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通過基因工程手段，構(gòu)建了高產(chǎn) L-天冬氨酸酶和 L-天冬氨酸-α-脫羧酶共表達(dá)重組菌株。主要技術(shù)指標(biāo)： 在轉(zhuǎn)化體系中，濕菌體添加量 20 g/L，底物 富馬酸 158.0 g/L，轉(zhuǎn)化周期 12~14 h，β-丙氨酸產(chǎn)量 118.6 g/L，底物摩爾轉(zhuǎn)化率 98%；(2) 濕菌體添加量 30 g/L，底物富馬酸 216.0 g/L，轉(zhuǎn)化 12~14 h，β-丙氨酸產(chǎn)量 162.1 g/L，底物摩爾轉(zhuǎn)化率 98%。 關(guān)鍵技術(shù) 以大腸桿菌為宿主，生長快，周期短，催化效率高；(2)以廉價(jià)的富馬酸為底物生產(chǎn)高附加值β-丙氨酸，成本低，收益高；(3)微生物轉(zhuǎn)化具有專一性強(qiáng)、條件溫和的優(yōu)點(diǎn)，該法綠色、環(huán)保、可持續(xù)，具有經(jīng)濟(jì)競爭力，有很好的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用前景。 

L-纈氨酸是生命有機(jī)體的重要組成部分，在生命體內(nèi)物質(zhì)代謝調(diào)控和信息傳遞等許多方面扮演著重要角色。L-纈氨酸屬于八種必需氨基酸之一，也是三種支鏈氨基酸之一。L-纈氨酸發(fā)酵是典型的代謝控制發(fā)酵。國內(nèi)雖有天然蛋白質(zhì)水解液分離提取 L-纈氨酸的產(chǎn)品，但由于其產(chǎn)量很低，質(zhì)量不佳，純度不高，所以無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn) L-纈氨酸具有原料成本低，反應(yīng)條件溫和及易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，是一種非常經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)方法。但是， 以微生物發(fā)酵法生產(chǎn) L-纈氨酸，國內(nèi)大多數(shù)菌株的產(chǎn)酸水平不高，特別是 L-纈氨酸的生產(chǎn)水平和產(chǎn)量遠(yuǎn)不能滿足國內(nèi)市場的需求。因此，開展發(fā)酵法生產(chǎn) L-纈氨酸的研究具有極其重要的意義。本研究室通過高通量篩選策略，獲得一株高產(chǎn)纈氨酸的黃色短桿菌。 

項(xiàng)目簡介 作為一種主要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，賴氨酸側(cè)鏈乙酰化及乙酰賴氨酸側(cè)鏈去乙酰化 已在近年證明能有效地調(diào)節(jié)多個(gè)關(guān)鍵生命過程，并且也已證明是發(fā)展人類疾病藥物（特 別是癌癥）的新型生物靶點(diǎn)。本成果發(fā)展了兩個(gè) Fmoc 保護(hù)的乙酰賴氨酸類似物（即 Fmoc硫乙酰賴氨酸和 Fmoc-甲磺酰賴氨酸）的有效制備方法及其成功應(yīng)用于基于 Fmoc 化學(xué)的 固相多肽合成。本課題組的前期工作已表明含有這兩個(gè)乙酰賴氨酸類似物的肽及肽類化 合物能作為發(fā)展下一代抗癌藥物的全新起點(diǎn)以及作為更近一步研究蛋白質(zhì)乙

用本方法制出的反芻動物飼料添加劑瘤胃保護(hù)性賴氨酸鹽酸鹽微膠囊包衣產(chǎn)品，可減少了賴氨酸在瘤胃中的降解，增加了小腸中賴氨酸的數(shù)量，克服了賴氨酸鹽酸鹽防潮性能差和存貯不便的缺點(diǎn)。本方法具有時(shí)間短、包衣效率高、制粒均勻等優(yōu)點(diǎn)。

γ-聚谷氨酸（Poly-γ-glutamic acid）是一種重要的天然聚合物，由于其具有良好的性質(zhì)已被廣泛應(yīng)用于食品，化妝品，醫(yī)藥，材料等領(lǐng)域。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）LL3 是一株谷氨酸非依賴型 γ-PGA 合成菌。為了提高其 γ-PGA 產(chǎn)量，項(xiàng)目組采用無痕基因編輯技術(shù)對菌株進(jìn)行了代謝工程改造。包括三部分：模塊化代謝通路改造；蔗糖代謝途徑改造；谷氨酸合成途徑改造。 B. amyloliquefaciens LL3 是項(xiàng)目組從發(fā)酵食品中分離得到，它能夠從蔗糖出發(fā)合成 γ-PGA。利用模塊化通路改造策略對 γ-PGA 合成相關(guān)的八個(gè)代謝通路進(jìn)行改造包括：γ-PGA 降解相關(guān)途徑；細(xì)胞呼吸鏈；胞外蛋白及胞外蛋白酶合成途徑；細(xì)菌多糖合成途徑；次級小分子代謝產(chǎn)物合成途徑；細(xì)胞自誘導(dǎo)因子合成途徑；谷氨酸合成途徑以及 γ-PGA 合成途徑。最終整合獲得的最優(yōu)基因工程菌株 NK-anti-rocG（敲除了 epsA-O 操縱子（負(fù)責(zé)胞外多糖合成），sac 操縱子（負(fù)責(zé)果聚糖合成），lps（脂多糖合成相關(guān)），pta（乙酸合成相關(guān)），pgdS（γ-PGA 降解酶），cwlO（細(xì)胞壁水解酶），luxS（AI-2 合成）以及表達(dá)anti-rocG sRNA（抑制谷氨酸脫氫酶表達(dá)））γ-PGA 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量從 3.8g/L 提高到 11.04 g/L，較對照菌株提高了 2.91 倍。γ-PGA 產(chǎn)物純度也從 78.6%提高到 95.2%。5-L 罐補(bǔ)料分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)得到 NK-anti-rocG菌株產(chǎn)量可達(dá) 20.3 g/L。分子量 450,000 Dal，純度 95%以上。 項(xiàng)目特色： 1. 菌種（Bacillus amyloliquefaciens）LL3 是谷氨酸非依賴型 γ-聚谷氨酸合成菌株；發(fā)酵生產(chǎn)主要原料為蔗糖； 2. 補(bǔ)料分批發(fā)酵產(chǎn)量為：20.3 g/L。 3. 授權(quán)專利號為：ZL200810053900.7 市場應(yīng)用前景： γ-聚谷氨酸（Poly-γ-glutamic acid）是一種重要的天然聚合物，由于其具有良好的性質(zhì)已被廣泛應(yīng)用于食品，化妝品，醫(yī)藥，材料等領(lǐng)域。本項(xiàng)目采用谷氨酸非依賴型 γ-聚谷氨酸合成菌做為發(fā)酵菌種，以蔗糖為原料發(fā)酵法生產(chǎn) γ-聚谷氨酸，可產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。

成果描述：該產(chǎn)品可用作食品添加劑，特別是面食產(chǎn)品（面包類產(chǎn)品）發(fā)酵的中和劑，也可作為痛風(fēng)病人緩解痛風(fēng)病痛的藥劑，以前是用濕法合成，產(chǎn)率低、時(shí)間長、純度不高，我們現(xiàn)研究用微波“濕一固相”合成方法在10~30分鐘內(nèi)（視反應(yīng)物量多少）在微波加熱條件下快速合成得到所需的產(chǎn)品，產(chǎn)率高、純度也高、時(shí)間短，可大大提高生產(chǎn)率和降低成本。生產(chǎn)中無三廢排放屬清潔工藝。市場前景分析：1、可應(yīng)用于面包行業(yè)作為發(fā)酵產(chǎn)品的中和劑，以代替目前用的小蘇打，從而避免用小蘇打產(chǎn)生配料變稀的情況，而且可同引入甘氨酸同步制成營養(yǎng)型面包。 2、可中和血液中的尿酸，作為醫(yī)治痛風(fēng)病人病痛的藥劑。與同類成果相比的優(yōu)勢分析：產(chǎn)率95%以上，純度95~98%以上。本產(chǎn)品過程中無三廢，主要消耗為能量（電能），而且本法比濕法可節(jié)約能量20~30%（主要是反應(yīng)條件不同，合成時(shí)間大大縮短，且產(chǎn)率提高）。

該產(chǎn)品可用作食品添加劑，特別是面食產(chǎn)品（面包類產(chǎn)品）發(fā)酵的中和劑，也可作為痛風(fēng)病人緩解痛風(fēng)病痛的藥劑，以前是用濕法合成，產(chǎn)率低、時(shí)間長、純度不高，我們現(xiàn)研究用微波“濕一固相”合成方法在10~30 分鐘內(nèi)（視反應(yīng)物量多少）在微波加熱條件下快速合成得到所需的產(chǎn)品，產(chǎn)率高、純度也高、時(shí)間短，可大大提高生產(chǎn)率和降低成本。生產(chǎn)中無三廢排放屬清潔工藝。

主要由 D-谷氨酸和 L-谷氨酸通過酰胺鍵聚合而成。作為一種高分子聚合物，γ-聚谷氨酸具有一些獨(dú)特的物理、化學(xué)和生物學(xué)特性如良好的水溶性，超強(qiáng)的吸附性，能徹底被生物降解，無毒無害，可食用等。在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥、化妝品，環(huán)保，合成纖維和涂膜等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，因此極具開發(fā)價(jià)值。 微生物絮凝劑是繼無機(jī)絮凝劑和有機(jī)絮凝劑之后出現(xiàn)的一種新型的、可自然降解的水處理劑，具有高效、無毒、無二次污染的特點(diǎn)。微生物絮凝劑是一類由微生物產(chǎn)生并分泌到細(xì)胞外具有絮凝活性的代謝產(chǎn)物，一般由多糖、蛋白質(zhì)、DNA、纖維素、糖蛋白、聚氨基酸等高分子物質(zhì)構(gòu)成，分子中含有多種官能團(tuán)，能使水中膠體懸浮物相互凝聚、沉淀。在傳統(tǒng)的絮凝劑中，無機(jī)絮凝劑投加量大，效果不佳，還會把大量金屬離子帶入最終產(chǎn)物中，對環(huán)境造成危害；有機(jī)合成高分子絮凝劑生物難降解，殘留單體有毒，會對環(huán)境造成二次污染。而微生物絮凝劑最突出的特點(diǎn)是具有生物降解性，而且高效、無毒、易降解、無二次污染且用途廣泛，是環(huán)境友好型絮凝劑，因而引起世界各國學(xué)者的廣泛關(guān)注和研究。

L-蘇氨酸在食品、飼料、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域的用量呈長期穩(wěn)定增長趨勢，尤其在飼料添加劑中增長最為迅速。以添加了 L-蘇氨酸的低蛋白配方飼料作為家禽日糧，不但可以緩解天然蛋白的匱乏，減少動物氨的排放，還能提高家禽的生產(chǎn)性能。而在醫(yī)藥領(lǐng)域，L-蘇氨酸除了用于氨基酸輸液之外，隨著人類保健意識的提高，各類氨基酸保健飲品涌現(xiàn)市場，L-蘇氨酸是必不可少的配方成分。L-蘇氨酸有望取代色氨酸，成為繼賴氨酸和甲硫氨酸之后第三大發(fā)展最迅速的氨基酸。因此 L-蘇氨酸產(chǎn)業(yè)迫切需要提高產(chǎn)量，降低成本，以滿足市場需求。本實(shí)驗(yàn)室以谷氨酸棒狀桿菌為出發(fā)菌株，通過代謝工程技術(shù)手段進(jìn)行基因敲除和敲入，對關(guān)鍵基因進(jìn)行了測序、蛋白結(jié)構(gòu)解析及定向改造，以達(dá)到“開源節(jié)流”，即增強(qiáng) L-蘇氨酸合成路徑代謝流，抑制或阻斷旁路途徑代謝流，最終提高L-蘇氨酸產(chǎn)率近 20 倍，具有較好的應(yīng)用前景。

L-甲硫氨酸廣泛應(yīng)用于飼料業(yè)，是家禽飼料中首選的限制性氨基酸。L-甲硫氨酸是強(qiáng)肝解毒劑、促進(jìn)發(fā)育劑，當(dāng)缺乏時(shí)會引起食欲減退。甲硫氨酸廣泛應(yīng)用于營養(yǎng)補(bǔ)充與畜產(chǎn)飼料，由于甲硫氨酸容易被雞吸收而轉(zhuǎn)變?yōu)殡u肉蛋白，在雞飼料中添加甲硫氨酸，可少耗飼料，并使雞肉生長健全。L-甲硫氨酸合成方法主要為化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法兩種。因化學(xué)合成法會產(chǎn)生大量有害物質(zhì)，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)甲硫氨酸越來越受到關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)室以谷氨酸棒狀桿菌為出發(fā)菌株，通過代謝工程技術(shù)手段進(jìn)行基因敲除和敲入，以達(dá)到“開源節(jié)流”，即增強(qiáng) L-甲硫氨酸合成路徑代謝流，抑制或阻斷旁路途徑代謝流，最終提高 L-甲硫氨酸產(chǎn)率，目前中間菌株產(chǎn)率已達(dá) 21 mmol/L，具有重要的應(yīng)用前景。