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開發(fā)了一個(gè)高效的捕獲RNA結(jié)合蛋白雙鏈RNA底物的建庫測(cè)序技術(shù)（irCLASH）以及后續(xù)的一整套生物信息學(xué)分析方法；首次在轉(zhuǎn)錄組水平上系統(tǒng)地繪制了人類ADAR蛋白的內(nèi)源雙鏈RNA底物圖譜；揭示了決定ADAR結(jié)合效率和編輯效率的底物特征和ADAR結(jié)合長雙鏈RNA的體內(nèi)模型。       該研究利用irCLASH技術(shù)系統(tǒng)構(gòu)建和分析了人類ADAR1、ADAR2及ADAR3的雙鏈RNA底物圖譜，發(fā)現(xiàn)與之前根據(jù)計(jì)算推導(dǎo)的研究設(shè)想不同，ADAR具有大量的、長距離的雙鏈RNA底物。該研究發(fā)現(xiàn)不完全互補(bǔ)配對(duì)的底物與ADAR蛋白也有很好的親和度，特別是ADAR2家族成員。研究還進(jìn)一步揭示了決定ADAR結(jié)合效率和編輯效率的底物特征。irCLASH測(cè)序技術(shù)及后續(xù)的整套生物信息學(xué)分析方法的開發(fā)為研究雙鏈RNA結(jié)合蛋白的內(nèi)源底物提供了新的工具。同時(shí)，該研究揭示的ADAR與底物相互作用及催化特性為研究人員開發(fā)高效的RNA編輯工具提供了資源寶庫及改進(jìn)方向。

肝癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是全球第五大常見的消化道惡性腫瘤，也是全球第三大致死性癌癥。我國肝癌病發(fā)率位居全球首位，肝癌已成為嚴(yán)重威脅我國人民健康和生命的疾病。由于肝癌的早期診斷缺乏可靠的生物標(biāo)志物，肝癌患者通常在肝癌晚期才被診斷，其5年生存率僅為15%。目前肝癌診斷主要依賴于影像學(xué)檢查或者血液活檢中的甲胎蛋白（AFP）標(biāo)志物等手段。但這些傳統(tǒng)方法對(duì)于癌變?cè)缙诖嬖诿舾行缘汀⑻禺愋缘偷染窒扌裕纾夯顧z中的甲胎蛋白特異性差，且往往到癌癥晚期才能檢測(cè)到其含量升高，可能延誤最佳的治療時(shí)機(jī)。因此亟需找到一種可用于肝癌診斷及預(yù)后的可靠的新型液體活檢標(biāo)志物。 液體活檢為一門新型的檢測(cè)技術(shù)，越來越受到關(guān)注。目前可以作為無創(chuàng)檢測(cè)的生物標(biāo)志物大多數(shù)是蛋白質(zhì)分子和DNA分子，但這些標(biāo)志物在靈敏度、誤診率和經(jīng)濟(jì)成本高等方面的缺陷導(dǎo)致它們很難被普及。RNA分子在細(xì)胞中擁有多個(gè)拷貝并且存在多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控形態(tài)，可以更加準(zhǔn)確地反映細(xì)胞狀態(tài)和癌癥動(dòng)態(tài)發(fā)展過程，而且其檢測(cè)成本也很低。 過去體液中的RNA標(biāo)志物研究主要集中在miRNA等小RNA的研究，相對(duì)于細(xì)胞中大量的長RNA，miRNA的數(shù)量要少一個(gè)到兩個(gè)數(shù)量級(jí)，因此提供的信息也有限。本項(xiàng)目另辟蹊徑，通過對(duì)大量肝癌患者（HCC）、慢性乙型肝炎患者(CHB)和健康個(gè)體(HD)進(jìn)行血漿中非編碼RNA表達(dá)譜的高通量測(cè)序檢測(cè)和分析，發(fā)現(xiàn)了一種非編碼RNA，srpRNA (RN7SL1)，的功能結(jié)構(gòu)域可以穩(wěn)定存在于血液中，并在區(qū)分肝癌患者和陰性對(duì)照組時(shí)具有良好的敏感度和特異性（約90%）。并且，通過在獨(dú)立驗(yàn)證集上的實(shí)時(shí)熒光定量檢驗(yàn)（RT-qPCR），該srpRNA (RN7SL1)的功能結(jié)構(gòu)域被證明在 肝癌的診斷及預(yù)后方面都具有可靠的臨床表現(xiàn)。

項(xiàng)目成果/簡介:肝癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是全球第五大常見的消化道惡性腫瘤，也是全球第三大致死性癌癥。我國肝癌病發(fā)率位居全球首位，肝癌已成為嚴(yán)重威脅我國人民健康和生命的疾病。由于肝癌的早期診斷缺乏可靠的生物標(biāo)志物，肝癌患者通常在肝癌晚期才被診斷，其5年生存率僅為15%。目前肝癌診斷主要依賴于影像學(xué)檢查或者血液活檢中的甲胎蛋白（AFP）標(biāo)志物等手段。但這些傳統(tǒng)方法對(duì)

利用A-to-I RNA編輯作為miRNA反義鏈表達(dá)的有利證據(jù)。通過靶向RNA測(cè)序技術(shù)，宋玉龍和李麗詩等利用A-to-I RNA編輯推導(dǎo)鏈表達(dá)的方向，揭示了miRNA基因座反義RNA的廣泛表達(dá)和編輯現(xiàn)象。宋玉龍和李麗詩等發(fā)現(xiàn)miRNA和其反義RNA形成了一個(gè)相互調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)：miRNA可以下調(diào)其反義RNA的表達(dá)水平；反義RNA在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控miRNA的表達(dá)和加工。此外，A-to-I RNA編輯可以穩(wěn)定反義RNA的結(jié)構(gòu)，避免其被配對(duì)的miRNA所降解。這一研究揭示了前人所未知的miRNA反義鏈編輯現(xiàn)象的廣泛性，為RNA編輯的研究開辟了新的研究方向。

   FTO對(duì)人體發(fā)育至關(guān)重要，F(xiàn)TO酶活功能的紊亂會(huì)影響發(fā)育和多種疾病的發(fā)生，包括肥胖和癌癥等。N6-甲基腺嘌呤（m6A）作為mRNA上含量最為豐富的甲基化修飾，是首個(gè)被報(bào)道的FTO去甲基酶活生理底物。之后陸續(xù)報(bào)道FTO生理底物還包括mRNA上5’帽端后的N6，2'-O-二甲基化腺嘌呤（cap m6Am），snRNA的m6A和m6Am，tRNA的N1-甲基腺嘌呤（m1A），除此之外還有體外活性底物單鏈DNA上的N6-甲基脫氧腺嘌呤（6mA）和N3-甲基胸腺嘧啶（3mT）與單鏈RNA上的N3-甲基尿嘧啶（m3U）。FTO如何識(shí)別眾多的核酸修飾堿基，是否有催化選擇性，如何結(jié)合多種RNA，F(xiàn)TO為什么對(duì)cap m6Am的活性高于單鏈RNA上的m6A，及FTO為什么對(duì)單鏈RNA或DNA上的m1A沒有活性卻對(duì)tRNA或莖環(huán)結(jié)構(gòu)上的m1A有活性？回答這些FTO的酶催化分子機(jī)制有待于蛋白-核酸復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的解析。然而FTO蛋白與核酸底物結(jié)合力太弱，致使獲得FTO蛋白-核酸復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)一直是該領(lǐng)域的挑戰(zhàn)和難點(diǎn)。

鑒定了擬南芥中的 m6A 去甲基酶 ALKBH10B ，發(fā)現(xiàn) ALKBH10B 缺失會(huì)導(dǎo)致擬南芥顯著的晚花表型， ALKBH10B 通過影響 FT ， SPL3 和 SPL9 的甲基化水平調(diào)控?cái)M南芥的成花誘導(dǎo)。不同的識(shí)別蛋白通過對(duì) m6A 的結(jié)合，對(duì) mRNA 的加工代謝產(chǎn)生不同的調(diào)控作用， 進(jìn)而 影響細(xì)胞不同的生理功能。通過開發(fā)甲醛交聯(lián)- 免疫共沉淀(Formaldehyde-crosslinking and immunoprecipitation, FA-CLIP) 技術(shù)，鑒定出全轉(zhuǎn)錄組水平的ECT2-mRNA 相互作用位點(diǎn)，揭示ECT2 主要結(jié)合mRNA 的 3' 非翻譯區(qū)(3'UTR), 并且傾向于結(jié)合保守序列 URUAY (R=G>A, Y=U>A,  其中 UGUAY 序列 占 90% 以上 ) 。使用植物細(xì)胞核裂解液進(jìn)行的體外酶活實(shí)驗(yàn)和凝膠遷移實(shí)驗(yàn)（ EMSA ）證明 UGUA 序列為 植物特有的m6A 保守序列，且UGUm6A 可以被ECT2 高特異性識(shí)別。亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明ECT2 蛋白分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，結(jié)合高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析，推測(cè)ECT2 具有雙重功能，ECT2 可能在細(xì)胞核中通過結(jié)合甲基化的UGUA 調(diào)控pre-mRNA 的 3'UTR 加工，在細(xì)胞質(zhì)中ECT2 促進(jìn)mRNA 的穩(wěn)定性。進(jìn)一步機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)影響表皮毛發(fā)育的三個(gè)基因ITB1, TTG1 及DIS2 的轉(zhuǎn)錄本可以被m6A 修飾且被ECT2 結(jié)合，在 ECT2 的T-DNA 插入突變體中，ITB1, TTG1 及DIS2 的mRNA 穩(wěn)定性降低，mRNA 表達(dá)量水平降低，繼而導(dǎo)致 ect2 突變體中表皮毛分叉數(shù)增多。

內(nèi)含子是基因中不具有編碼作用的片段，它會(huì)被轉(zhuǎn)錄到前體RNA中，但在mRNA加工過程中被剪切掉，而內(nèi)含子剪切是真核生物mRNA成熟的關(guān)鍵步驟。在酵母中，當(dāng)RNA聚合酶II(Pol-II)轉(zhuǎn)錄到內(nèi)含子下游45nt時(shí)已經(jīng)有一半的內(nèi)含子完成了剪切。但高等真核生物，尤其植物中RNA共轉(zhuǎn)錄剪切速率，剪切狀態(tài)和其他RNA加工過程之間的關(guān)系又是什么樣的呢？為解答這一疑惑，翟繼先課題組開展了系列研究分析。

研究開發(fā)了 “ 熒光團(tuán)輔助的 RNA 鄰近標(biāo)記和測(cè)序技術(shù) ” ，簡稱 “CAP-seq” 。   該方法通過可見光激發(fā)遺傳靶向的光敏蛋白 miniSOG 產(chǎn)生活性氧， 介 導(dǎo)鄰近 RNA 分子上的鳥嘌呤與具有生物正交功能把手的氨基探針進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)，既而通過富集純化與高通量測(cè)序檢測(cè)，實(shí)現(xiàn) miniSOG 定位的亞細(xì)胞區(qū)域內(nèi) 轉(zhuǎn)錄 組的空間特異性標(biāo)記與鑒定。 利用 CAP-seq ，他們系統(tǒng)研究了幾個(gè)亞細(xì)胞區(qū)域的轉(zhuǎn)錄組，包括線粒體基質(zhì)轉(zhuǎn)錄組 、 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面 轉(zhuǎn)錄組 以及 線粒體外膜附近轉(zhuǎn)錄組。這些研究結(jié)果表明 CAP-seq 對(duì) 活細(xì)胞中開放區(qū)域的 RNA 標(biāo)記具有良好的空間特異性和覆蓋度 。 他們?cè)诰€粒體外膜附近檢測(cè)到 30 個(gè)編碼氧化磷酸化途徑相關(guān)蛋白的 RNA 和多達(dá) 55 個(gè)編碼核糖體蛋白的 mRNA ，這一結(jié)果不僅支持了線粒體蛋白在線粒體外膜被翻譯后直接轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)線粒體的模型，還暗示著線粒體功能可能與蛋白質(zhì)的翻譯調(diào)節(jié)有關(guān)。 CAP-seq 具有操作簡單、空間選擇性高、生物相容性好的特點(diǎn)，將成為一項(xiàng)適合于在多種生物系統(tǒng)中研究亞細(xì)胞 轉(zhuǎn)錄組 的新技術(shù)。

真核生物中，mRNA的降解對(duì)于mRNA的數(shù)量和質(zhì)量調(diào)控都發(fā)揮關(guān)鍵的作用。成熟的mRNA在細(xì)胞中作為模板指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成，而參與蛋白質(zhì)翻譯的mRNA的數(shù)量受到精確調(diào)控。這一過程不僅取決于基因的轉(zhuǎn)錄水平，也決定于mRNA的降解速率。mRNA 降解主要包括多聚腺苷酸尾（polyA tail）的去除，脫帽（decapping）和核酸酶（ribonuclease）的消化。新近的研究表明，植物細(xì)胞中mRNA也可以在蛋白翻譯進(jìn)行的同時(shí)被核酸酶消化，即mRNA逐步退出蛋白翻譯過程與其降解是偶聯(lián)的過程。為保證蛋白翻譯的準(zhǔn)確性，植物細(xì)胞主要通過依賴翻譯的mRNA質(zhì)量監(jiān)控機(jī)制進(jìn)行缺陷mRNA的分選及清除，從而實(shí)現(xiàn)mRNA質(zhì)量的調(diào)控。這些mRNA質(zhì)量監(jiān)控機(jī)制同時(shí)也可以作為一種基因表達(dá)調(diào)控方式精細(xì)調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育及環(huán)境適應(yīng)性。在有缺陷的mRNA不能被核酸酶及時(shí)清除時(shí)，植物啟動(dòng)依賴小RNA的轉(zhuǎn)錄后基因沉默途徑（PTGS, posttranscriptional gene silencing）加以剪切使其喪失功能。轉(zhuǎn)錄后基因沉默作為一種防御手段清除過量產(chǎn)生的異常mRNA尤其是外源基因表達(dá)的mRNA，同時(shí)mRNA降解途徑確保轉(zhuǎn)錄后基因沉默極少作用于內(nèi)源編碼基因。該綜述對(duì)上述過程的分子機(jī)制及其在植物中的生物學(xué)功能進(jìn)行梳理論述，并展望植物領(lǐng)域關(guān)于mRNA動(dòng)態(tài)降解以及mRNA的數(shù)量和質(zhì)量監(jiān)控機(jī)制有待研究的問題。

哺乳動(dòng)物基因組的廣泛轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生了大量的非編碼RNA，相比于細(xì)胞質(zhì)定位的蛋白編碼mRNA，這些非編碼RNA如長鏈非編碼RNA（lncRNA）、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子關(guān)聯(lián)的不穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄本（uaRNA、eRNA）等更傾向于結(jié)合染色質(zhì)參與調(diào)控染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄和RNA加工等過程。盡管零星報(bào)導(dǎo)少數(shù)RNA核滯留的現(xiàn)象，但為何大部分lncRNA會(huì)滯留于染色質(zhì)上行使調(diào)控功能，仍是個(gè)不解之謎。上世紀(jì)80年代初，Joan Steitz通過系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血液抗體分離提取 U1,U2, U4, U5和U6小核糖核蛋白粒子（又稱為 snRNP），揭示了它們參與RNA剪接的經(jīng)典功能。近年來施一公團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)報(bào)導(dǎo)了真核生物剪切體的原子結(jié)構(gòu)和生化功能。然而，一直讓人困惑的是，細(xì)胞內(nèi)U1 snRNP的數(shù)量為什么比其它剪接相關(guān)snRNP高 2-5倍。雖然Gideon Dreyfuss和Phil Sharp等團(tuán)隊(duì)曾揭示U1 snRNP調(diào)控轉(zhuǎn)錄終止和方向的非經(jīng)典功能，U1 snRNP在細(xì)胞中的豐富存在仍然是一個(gè)讓人困惑的問題。為了探究lncRNA的染色質(zhì)結(jié)合機(jī)制，研究者首先建立和運(yùn)用一套新穎的mutREL-seq方法來高精度篩選調(diào)控RNA定位的關(guān)鍵序列，意外發(fā)現(xiàn)了U1 snRNP識(shí)別位點(diǎn)參與調(diào)控候選RNA的染色質(zhì)滯留。相比于蛋白編碼基因，lncRNA轉(zhuǎn)錄本含有更多的U1識(shí)別位點(diǎn)（同時(shí)也是潛在的5’剪接供體位點(diǎn)），而其基因組區(qū)域具有更少的3’剪接受體位點(diǎn)。并且U1 snRNP更高水平地結(jié)合在lncRNA上。隨后，研究者分別使用antisense morpholino oligos（AMO）和auxin-induced degron（AID）誘導(dǎo)蛋白降解系統(tǒng)，來抑制U1 snRNA和核心蛋白組分SNRNP70的功能。研究者發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎干細(xì)胞中近一半的lncRNA受U1 snRNP調(diào)控。另外，與轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件關(guān)聯(lián)的不穩(wěn)定非編碼轉(zhuǎn)錄本如uaRNA、eRNA等，它們的染色質(zhì)結(jié)合在U1 snRNP抑制后也顯著下降。研究者進(jìn)一步證明了U1 snRNP直接調(diào)控成熟lncRNA與染色質(zhì)的結(jié)合，而不是通過影響RNA合成、加工或降解過程的動(dòng)態(tài)變化所產(chǎn)生的間接影響。機(jī)制上，研究者鑒定了U1 snRNP在染色質(zhì)上的互作蛋白，發(fā)現(xiàn)U1 snRNP結(jié)合特定磷酸化狀態(tài)的RNA轉(zhuǎn)錄聚合酶II（Pol II）。轉(zhuǎn)錄抑制明顯降低了U1 snRNP及其所調(diào)控的非編碼RNA與染色質(zhì)的結(jié)合，表明U1 snRNP通過與磷酸化的Pol II互作來介導(dǎo)其互作RNA與染色質(zhì)的結(jié)合。最后，研究者通過以lncRNA Malat1為例，進(jìn)一步驗(yàn)證了U1 snRNP對(duì)其染色質(zhì)結(jié)合的調(diào)控作用。去除SNRNP70后，絕大部分Malat1 “核斑”定位信號(hào)消失，并彌散在核質(zhì)及細(xì)胞質(zhì)中。同時(shí)，Malat1在活躍表達(dá)基因染色質(zhì)區(qū)域的結(jié)合信號(hào)顯著下降，表明U1 snRNP不僅可以將Malat1滯留在染色質(zhì)上，同時(shí)也參與調(diào)控后者在染色質(zhì)上的移動(dòng)及其與靶基因的結(jié)合。綜上，研究者提出如下模型（圖1）：5’和3’剪接位點(diǎn)在lncRNA上的不對(duì)稱分布，致使U1 snRNP持續(xù)結(jié)合在lncRNA轉(zhuǎn)錄本上，而不能通過RNA剪接過程釋放，從而介導(dǎo)了lncRNA的染色質(zhì)滯留。磷酸化Pol II進(jìn)一步介導(dǎo)了lncRNA-U1 snRNP復(fù)合體在染色質(zhì)上的移動(dòng)（mobilization）。對(duì)于大多數(shù)低豐度、不穩(wěn)定的lncRNA，它們只能靶向結(jié)合鄰近的染色質(zhì)區(qū)域（順式cis作用）；而對(duì)于少數(shù)穩(wěn)定和高豐度的lncRNA，如Malat1，U1 snRNP促進(jìn)了其遷移和結(jié)合更多的靶基因區(qū)域（反式trans作用）。圖1. U1 snRNP介導(dǎo)非編碼RNA染色質(zhì)結(jié)合的模式圖。論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41586-020-2105-3