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本技術(shù)首先根據(jù)鴨胸軟骨的化學(xué)組成設(shè)計(jì)了一種用于提取鴨硫 酸軟骨素的新型復(fù)合蛋白酶的基礎(chǔ)配方，并利用復(fù)配酶制備鴨硫酸軟骨素，其 工藝包括鴨胸軟骨骨粉的制備、鴨胸軟骨骨粉的酶解提取、蛋白質(zhì)的沉降、硫 酸軟骨素粉末四個(gè)步驟。本發(fā)明采用了復(fù)配酶解法提取鴨胸軟骨的硫酸軟骨素， 采用新型復(fù)合蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)配，去掉了堿提這一步，在復(fù)配酶使用上也 進(jìn)行了優(yōu)化，其收率比其它方法提高了 20%左右，產(chǎn)品純度達(dá)到 90%~95%。用復(fù) 合酶代替稀堿或濃堿解離軟骨能夠大大降低對(duì)環(huán)境的污染，并且可以有效縮短 生產(chǎn)周期、降低生產(chǎn)成本、增加了產(chǎn)品收率、提高產(chǎn)品質(zhì)量，填補(bǔ)了該領(lǐng)域的 空白。 技術(shù)優(yōu)點(diǎn)或者效益預(yù)測(cè):硫酸軟骨素(Chondroitinsulfate，CS)是 D-葡萄糖 醛酸和 N-乙酰氨基半乳糖以β-1,4-糖苷鍵連接而成的重復(fù)二糖單位組成的酸 性黏多糖。硫酸軟骨素具有抗凝血、抗炎癥、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、降血 脂、防止動(dòng)脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)體內(nèi)水分、清除自由基和延緩衰老等多種生理功 能，可應(yīng)用于食品、藥品、各種保健品及高檔化妝品中。我國(guó)是全球硫酸軟骨 素產(chǎn)量最大的國(guó)家，占全球產(chǎn)量的 80%以上，年平均產(chǎn)量多于 4000 噸；我國(guó)硫 酸軟骨素主要出口到美國(guó)、歐洲、日本等地，其中美國(guó)作為我國(guó)硫酸軟骨素第 一大出口市場(chǎng)，出口份額約占 50%。所以，隨著硫酸軟骨素生物活性功能不斷研 究及其應(yīng)用領(lǐng)域的不斷擴(kuò)展，硫酸軟骨素用途越來(lái)越廣，具有廣闊市場(chǎng)應(yīng)用前 景。

Mpa六聚體除了與真核生物蛋白酶體調(diào)節(jié)顆粒Rpt1-Rpt6蛋白六聚體以及古細(xì)菌PAN蛋白六聚體具有一定的結(jié)構(gòu)同源性之外，還具有一些明顯不同的結(jié)構(gòu)特征：（1）結(jié)核桿菌Mpa具有形成雙環(huán)的兩個(gè)串聯(lián)寡核苷酸/寡糖結(jié)合（OB）結(jié)構(gòu)域，而古細(xì)菌蛋白酶體相關(guān)ATPase調(diào)控顆粒（PAN）和真核生物蛋白酶體ATPase調(diào)控顆粒復(fù)合體（Rpt1-6）每個(gè)蛋白亞基都只具有單個(gè)OB結(jié)構(gòu)域；（2）Mpa在具有蛋白酶體活化功能的C末端之前具有一個(gè)泛素樣的β-grasp結(jié)構(gòu)域，而古細(xì)菌PAN和真核生物Rpt1-6蛋白復(fù)合體并不具有這樣的一個(gè)β-grasp結(jié)構(gòu)域? 由于β-grasp結(jié)構(gòu)域的存在，Mpa六聚體中各個(gè)蛋白亞基C末端被埋在結(jié)構(gòu)核心中而沒(méi)有暴露在蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)的表面，這就影響了C末端的GQYL基序與20S 蛋白酶體復(fù)合體的對(duì)接，從而阻礙了六聚化的Mpa與七次對(duì)稱的28聚體的蛋白酶體相互作用。我們通過(guò)功能研究進(jìn)一步解釋了為什么單獨(dú)的Mpa六聚體在體外情況下不能有效結(jié)合蛋白酶體核心顆粒并啟動(dòng)蛋白質(zhì)特異性降解，結(jié)合晶體結(jié)構(gòu)域功能研究，我們提出了結(jié)核桿菌蛋白酶體ATPase調(diào)控顆粒Mpa與20S蛋白酶體復(fù)合體這一分子量超過(guò)1100KDa蛋白質(zhì)機(jī)器的作用模型

本發(fā)明涉及一種綠盲蝽唾液酶中蛋白酶與纖維素酶的體外提取測(cè)定方法，利用Paraflim膜，采取膜夾營(yíng)養(yǎng)法提取綠盲蝽唾液酶，并測(cè)定綠盲蝽中蛋白酶與纖維素酶的活性，Paraflim膜法提取綠盲蝽唾液酶利用Paraflim膜、膠卷盒、紗布、橡皮筋、位于兩層Paraflim膜間的液體營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)，利用酶與底物反應(yīng)的原理，測(cè)定綠盲蝽唾液中蛋白酶、纖維素酶的活性。本方法材料易得，操作簡(jiǎn)單方便，制作成本低，占空間小，可實(shí)現(xiàn)綠盲蝽唾液酶的大量、批量提取，并且綠盲蝽可繼續(xù)回收利用。

傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物，如烷化劑、鉑類試劑、作用于核酸合成的藥物、作用于微管蛋白合成 的藥物等，一般存在毒性較大、選擇性較低等問(wèn)題，因此，研究尋找安全有效、選擇性較好的 靶向性抗腫瘤藥物具有重大的科學(xué)意義和巨大的社會(huì)價(jià)值。 組蛋白去乙酰化酶 (Histone Deacetylase，HDAC) 是治療腫瘤的新靶標(biāo)，其抑制劑 Vorinostat (SAHA) 和Romidepsin (FK228) 已分別于2006年和2009年經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市用于治 療表皮T細(xì)胞淋巴瘤；該類抑制劑顯示出良好的腫瘤治療效果及較小的毒副作用，是目前最具 前景的抗腫瘤藥物之一。 本項(xiàng)目綜合運(yùn)用分子動(dòng)力學(xué)模擬、計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)、化學(xué)合成、藥理學(xué)活性測(cè)試等 方法，通過(guò)“設(shè)計(jì)－合成/修飾－測(cè)試”的多次循環(huán)，開(kāi)發(fā)了一系列結(jié)構(gòu)新穎的四氫-γ-咔啉骨 架的HDAC抑制劑。該類抑制劑可以有效抑制HDAC總酶及HDAC1的活性，多個(gè)化合物的酶 活性都低于50 nM；并且，該系列多數(shù)化合物對(duì)Hela、A549、HCT116、K562、MCF-7等腫瘤細(xì) 胞株表現(xiàn)出比陽(yáng)性對(duì)照藥物SAHA更高的活性，多個(gè)化合物對(duì)所測(cè)腫瘤細(xì)胞株的抑制活性低于 1 μM，而對(duì)于人類正常細(xì)胞無(wú)抑制活性；在動(dòng)物模型試驗(yàn)中，代表性化合物對(duì)接種Lewis肺癌 荷瘤小鼠模型表現(xiàn)出良好的治療效果，且沒(méi)有觀察到明顯的體重變化和毒性反應(yīng)。因此，該類 HDAC抑制劑可以作為藥物先導(dǎo)化合物用于制備抗腫瘤藥物，為廣大腫瘤病患者帶來(lái)福音，也 向開(kāi)發(fā)我國(guó)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗腫瘤藥物邁進(jìn)一步。 

本發(fā)明公開(kāi)了一種產(chǎn)角蛋白酶的粘金黃桿菌及其分離方法。所述粘金黃桿菌拉丁名為Chryseobac？terium？L99，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC？No.2295。本發(fā)明公開(kāi)了該菌的形態(tài)學(xué)特征為：菌體桿狀，不產(chǎn)孢子，無(wú)運(yùn)動(dòng)性，革蘭氏染色呈陰性。本發(fā)明公開(kāi)了該菌的全細(xì)胞脂肪酸主要成份為：十三甲基十四酸47.59％，二羥基-13-甲基十四酸和(或)Ω-7-順式-13甲基-十五酸15.72％，三羥基-15-甲基十六酸13.91％，Ω-9-順式-14甲基棕櫚酸9.48％。本發(fā)明還公開(kāi)了該菌的16S核糖體DNA(16S？rDNA)全序列。本發(fā)明公開(kāi)的分離方法包括三個(gè)步驟：普通營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基富集培養(yǎng)，以角蛋白為唯一碳氮源固體培養(yǎng)基初篩，以角蛋白為唯一碳氮源液體培養(yǎng)基的復(fù)篩。該方法快捷有效，所得菌種產(chǎn)酶能力強(qiáng)。

蛋白酶體是細(xì)胞用來(lái)調(diào)控特定蛋白質(zhì)的濃度和清除錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的主要機(jī)制，是細(xì)胞中最普遍的不可或缺的大型 蛋白復(fù)合機(jī)器之一，也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最大的蛋白降解機(jī)器。 蛋白酶體全酶是由蓋子 (Lid)和基座(Base)亞復(fù) 合體組成的調(diào)控顆粒RP(Regulatory Particle)所激活。基座亞復(fù)合體在組裝過(guò)程中最重要的一個(gè)步驟是異質(zhì)六 聚AAA-ATPase環(huán)的組裝。這個(gè)過(guò)程至少需要被PAAF1, p28/gankyrin, p27/PSMD9和S5b這四種調(diào)控顆粒(RP)組 裝伴侶蛋白分子所引導(dǎo)。天然的自由態(tài)19S調(diào)控復(fù)合體的構(gòu)象存在大量的亞穩(wěn)定態(tài)，并表現(xiàn)出大幅度的局部構(gòu)象漲 落，使冷凍電子顯微鏡技術(shù)成為解析其結(jié)構(gòu)的唯一手段。利用 冷凍電鏡解析人源蛋白酶體全酶的基礎(chǔ)上（見(jiàn)PNAS 2016, 113: 12991-12996），利用他們自主開(kāi)發(fā)的基于統(tǒng)計(jì) 流行算法的高性能計(jì)算軟件ROME（見(jiàn)PLoS ONE 2017, 12:e0182130）與優(yōu)化的冷凍電鏡處理方法對(duì)p28-RP復(fù)合 體細(xì)微動(dòng)態(tài)構(gòu)象進(jìn)行深度分類，共解析出了1個(gè)4.5-? p28綁定的調(diào)控顆粒（RP）非AAA的亞復(fù)合體，3個(gè)近7-? p28 綁定的完整RP結(jié)構(gòu)，1個(gè)亞納米精度下的非p28綁定的完整RP結(jié)構(gòu)以及7個(gè)亞納米精度下的由Rpn1-p28-AAA組成的p28 綁定RP的亞復(fù)合體的動(dòng)態(tài)構(gòu)象。觀察到自由態(tài)RP調(diào)控顆粒中p28-綁定的AAA環(huán)并沒(méi)有組成的閉 環(huán)孔狀通道，而是自發(fā)地在Rpt2-Rpt6和Rpt3-Rpt4界面上形成多個(gè)由“開(kāi)”到“關(guān)”的拓?fù)渥儤?gòu)。

該成果涉及食品生物等高新技術(shù)領(lǐng)域，是一種具有抑制腐敗作用的低值魚(yú)蛋白深度酶解的方法。通過(guò)創(chuàng)造性地在低值魚(yú)酶解過(guò)程中不斷通入凈化空氣或氧氣，抑制和殺滅引致水解物腐敗變質(zhì)的厭氧菌；利用內(nèi)切蛋白酶與外切蛋白酶的協(xié)同作用，明顯提高了魚(yú)蛋白水解效率，可得水解度大于65%，氮回收率大于85%的低值魚(yú)蛋白深度酶解液，顯著降低了低值魚(yú)酶解成本。 該成果避免現(xiàn)有技術(shù)采用化學(xué)殺菌劑所導(dǎo)致的對(duì)蛋白酶活性的抑制、化學(xué)殺菌劑殘留的問(wèn)題，以及使用熱殺菌方法所導(dǎo)致的降低魚(yú)蛋白水解效率的問(wèn)題，解決了低值魚(yú)酶解過(guò)程易

11月4日，天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王濤課題組在Journal of Virology在線發(fā)表了最新研究成果，論文題目為“Enterovirus D68 Protease 2AproTargets TRAF3 to Subvert Host Innate Immune Responses”。 腸道病毒EV-D68（Enterovirus D68）可引起典型上呼吸道感染癥狀，同時(shí)還會(huì)誘發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如急性弛緩性麻痹和急性無(wú)力脊髓炎等。近年來(lái)，我國(guó)對(duì)EV-D68的檢出率逐漸升高，存在大規(guī)模暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。腸道病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白2A蛋白酶（2Apro）是協(xié)助病毒逃避宿主天然免疫的關(guān)鍵蛋白。 王濤團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)在感染EV-D68后，2Apro可顯著抑制SEV誘導(dǎo)的Ⅰ型干擾素反應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，2Apro能夠分別在HeLa和HEK293T細(xì)胞中切割TRAF3的C端區(qū)域，切割后得到的條帶大小為40 kDa左右。同時(shí)，2Apro中第107位氨基酸的半胱氨酸被丙氨酸取代后，喪失對(duì)TRAF3的切割活性，而TRAF3中第462位氨基酸甘氨酸突變?yōu)楸彼釙r(shí)，表現(xiàn)出對(duì)2Apro切割的抗性。 本研究發(fā)現(xiàn)了EV-D68的2Apro能夠切割宿主天然免疫通路中的TRAF3蛋白，從而破壞宿主的先天免疫應(yīng)答，并對(duì)2Apro和TRAF3切割的具體位點(diǎn)和機(jī)制做了詳細(xì)報(bào)道。

項(xiàng)目成果/簡(jiǎn)介:11月4日，天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王濤課題組在Journal of Virology在線發(fā)表了最新研究成果，論文題目為“Enterovirus D68 Protease 2AproTargets TRAF3 to Subvert Host Innate Immune Responses”。 腸道病毒EV-D68（Enterovirus D68）可引起典型上呼吸道感染癥狀，同時(shí)還會(huì)誘發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如急性弛緩性麻痹和急性無(wú)力脊髓炎等。近年來(lái)，我國(guó)對(duì)EV-D68的檢出率逐漸升高，存在大規(guī)模暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。腸道病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白2A蛋白酶（2Apro）是協(xié)助病毒逃避宿主天然免疫的關(guān)鍵蛋白。 王濤團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)在感染EV-D68后，2Apro可顯著抑制SEV誘導(dǎo)的Ⅰ型干擾素反應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，2Apro能夠分別在HeLa和HEK293T細(xì)胞中切割TRAF3的C端區(qū)域，切割后得到的條帶大小為40 kDa左右。同時(shí)，2Apro中第107位氨基酸的半胱氨酸被丙氨酸取代后，喪失對(duì)TRAF3的切割活性，而TRAF3中第462位氨基酸甘氨酸突變?yōu)楸彼釙r(shí)，表現(xiàn)出對(duì)2Apro切割的抗性。 本研究發(fā)現(xiàn)了EV-D68的2Apro能夠切割宿主天然免疫通路中的TRAF3蛋白，從而破壞宿主的先天免疫應(yīng)答，并對(duì)2Apro和TRAF3切割的具體位點(diǎn)和機(jī)制做了詳細(xì)報(bào)道。

蛋白酶體是細(xì)胞中用來(lái)調(diào)控特定蛋白質(zhì)的濃度和清除錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的主要機(jī)制的核心組成部分，是細(xì)胞中最普遍的不可或缺的大型全酶超分子復(fù)合機(jī)器之一，也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最大的蛋白降解機(jī)器。人源蛋白酶體全酶包含至少64個(gè)亞基，由蓋子 (Lid)和基座(Base)亞復(fù)合體組成的調(diào)控顆粒RP(Regulatory Particle)所激活。2016年，該課題組與其合作者在《美國(guó)科學(xué)院院刊》報(bào)道了人源蛋白酶體的基態(tài)近原子分辨的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，以及三個(gè)亞納米分辨的RP-CP亞復(fù)合體亞穩(wěn)或過(guò)渡態(tài)的共存結(jié)構(gòu)，并首次發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)亞穩(wěn)態(tài)構(gòu)象的CP的底物轉(zhuǎn)運(yùn)通道處于開(kāi)放狀態(tài)（見(jiàn)PNAS 2016, 113: 12991-12996）。這一發(fā)現(xiàn)被德國(guó)馬普所Baumeister課題組及其合作者在2017年的一篇《美國(guó)科學(xué)院院刊》論文中通過(guò)酵母蛋白酶體全酶的冷凍電鏡亞納米精度分析進(jìn)一步證實(shí)、引用和比較（見(jiàn)PNAS 2017, 114, 1305-1310）。然而，在這些工作中，CP開(kāi)放態(tài)的全酶結(jié)構(gòu)離近原子分辨還有較大距離，未能充分揭示人源蛋白酶體全酶的激活后的運(yùn)動(dòng)行為。毛有東、歐陽(yáng)頎課題組及其合作者在前期工作的基礎(chǔ)上，利用他們自主開(kāi)發(fā)的基于統(tǒng)計(jì)流行算法的高性能計(jì)算軟件ROME（見(jiàn)PLoS ONE 2017, 12:e0182130）與優(yōu)化的冷凍電鏡處理方法，對(duì)ATP-γS結(jié)合狀態(tài)下的人源蛋白酶體的全酶冷凍電鏡單顆粒數(shù)據(jù)展開(kāi)了深入分析，得到了6個(gè)共存的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，其中包括3.6埃分辨率的基態(tài)結(jié)構(gòu)，3.5埃的開(kāi)放態(tài)CP結(jié)構(gòu)，和三個(gè)CP開(kāi)放態(tài)對(duì)應(yīng)的亞穩(wěn)簡(jiǎn)并態(tài)全酶4.2埃，4.3埃和4.9埃的結(jié)構(gòu)。另外兩個(gè)中間態(tài)結(jié)構(gòu)分辨率為7.0埃和5.8埃。三個(gè)CP開(kāi)放態(tài)對(duì)應(yīng)的全酶結(jié)構(gòu)的主要差別在于位于RP的AAA-ATPase激酶馬達(dá)模塊，伴隨其不同的構(gòu)象變化，至少有四個(gè)ATP-γS分子穩(wěn)定結(jié)合在不同的AAA-ATPase亞基上，為其在不同核酸結(jié)合狀態(tài)下形成的非穩(wěn)定動(dòng)態(tài)構(gòu)象提供了重要證據(jù)。該研究首次觀察到位于AAA-ATPase激酶馬達(dá)模塊中心的底物轉(zhuǎn)運(yùn)通道呈現(xiàn)從螺旋到鞍形不同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)變化，為進(jìn)一步分析底物和蛋白酶體全酶的相互作用奠定了重要基礎(chǔ)。人源蛋白酶體全酶AAA-ATPase馬達(dá)模塊中心的底物轉(zhuǎn)運(yùn)通道發(fā)生大幅度的拓?fù)渥儤?gòu)