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項(xiàng)目成果/簡(jiǎn)介:溶瘤痘苗病毒在體內(nèi)有四種形式，其中EEV外包裹細(xì)胞膜，能逃避機(jī)體免疫反應(yīng)，使其特別適合靜脈注射（圖A）。表達(dá)治療基因A的溶瘤痘苗病毒有非常好的治療效果（圖B），VV-A與和PD-1抗體很好的協(xié)同作用（圖C）。知識(shí)產(chǎn)權(quán)類(lèi)型:發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)先進(jìn)程度:達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平成果獲得方式:獨(dú)立研究獲得政府支持情況:國(guó)家級(jí)計(jì)劃/專(zhuān)項(xiàng)類(lèi)別:國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃獲得經(jīng)費(fèi):445.00萬(wàn)元

基因治療現(xiàn)已成為攻克腫瘤最具希望，也是研究最為活躍的領(lǐng)域。基因?qū)胂到y(tǒng)是基因治療的核心技術(shù)。現(xiàn)階段面臨的最大難題在于尚未找到理想的基因載體，治療基因的導(dǎo)入仍然是腫瘤基因治療的瓶頸。非病毒載體近年來(lái)發(fā)展迅速，其中聚乙烯亞胺(polyethylenimine PEI)是近年來(lái)研究最為廣泛的陽(yáng)離子多聚物非病毒基因載體。 本項(xiàng)目針對(duì)聚乙烯亞胺（PEI）轉(zhuǎn)基因載體使用中存在的轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞毒性相矛盾及靶向性差等問(wèn)題，采用生物可降解技術(shù)、金屬離子配位技術(shù)等連接低分子量聚乙烯亞胺(LMW PEI)，得到多分枝狀或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子量PEI衍生物，進(jìn)而選擇腫瘤主動(dòng)靶向多肽RGD、tLype-1等，與細(xì)胞穿膜肽TAT(49-57)、核定位信號(hào)肽NLS連接，合成具有多功能的數(shù)種功能肽RGDC-TAT、RGDC-TAT-NLS、tLype-1-NLS等，利用交聯(lián)技術(shù)將多功能與PEI衍生物偶聯(lián)，從而構(gòu)建新型非病毒基因載體系統(tǒng)，旨在保證較高轉(zhuǎn)染效率情況下，降低PEI細(xì)胞毒性，增加其對(duì)腫瘤的靶向性，克服當(dāng)前非病毒基因載體的瓶頸問(wèn)題，為基因治療探索一條有效途徑。 本項(xiàng)目受?chē)?guó)家自然科學(xué)基金、上海市科委國(guó)際學(xué)術(shù)合作項(xiàng)目及上海市教委科研創(chuàng)新項(xiàng)目資助，發(fā)表學(xué)術(shù)論文數(shù)十篇，申請(qǐng)發(fā)明專(zhuān)利10項(xiàng)，其中授權(quán)7項(xiàng)。

溶瘤痘苗病毒在體內(nèi)有四種形式，其中EEV外包裹細(xì)胞膜，能逃避機(jī)體免疫反應(yīng)，使其特別適合靜脈注射（圖A）。表達(dá)治療基因A的溶瘤痘苗病毒有非常好的治療效果（圖B），VV-A與和PD-1抗體很好的協(xié)同作用（圖C）。

本發(fā)明的目的是提供一種鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗，即篩選獲得鴨坦布蘇病毒E蛋白具有優(yōu)勢(shì)抗原表位的DomainIII結(jié)構(gòu)域，并通過(guò)Lingker與腸毒素LTB組成新型融合蛋白LTB-Es，并以該融合蛋白作為抗原來(lái)制備鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗。本發(fā)明中鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白LTB-Es，其編碼蛋白的氨基酸序列為SEQIDNO:1；其中一種核苷酸序列為SEQIDNO:2。本發(fā)明利用原核表達(dá)載體構(gòu)建了能表達(dá)鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白LTB-Es的大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌。將重組表達(dá)的蛋白純化后制備成基因工程亞單位疫苗，可使免疫后鴨群獲得免疫保護(hù)。

本成果是將人工合成的表達(dá)豬圓環(huán)病毒 2 型 Cap 蛋白的核苷酸 序列克隆到桿狀病毒表達(dá)載體中，構(gòu)建重組桿狀病毒，接種 Sf9 昆蟲(chóng)細(xì)胞，經(jīng) 過(guò)懸浮培養(yǎng)、收獲、過(guò)濾，二乙烯亞胺 BEI 滅活病毒液后，加入適宜的佐劑混 合乳化制成。并利用自主分離鑒定副豬嗜血桿菌病多價(jià)流行菌株，通過(guò)優(yōu)化培 養(yǎng)工藝，提高副豬嗜血桿菌培養(yǎng)密度，成功研制了豬圓環(huán)病毒 2 型-副豬嗜血桿 菌多聯(lián)多價(jià)滅活疫苗。 

已有樣品/n成功將全長(zhǎng)的西妥昔單抗基因分別克隆至腺病毒載體AdC68和Hu5，構(gòu)建重組腺病毒AdC68-CEb和Hu5-CEb，通過(guò)WesternBlot4證明成功表達(dá)了西妥昔單抗；我們進(jìn)一步通過(guò)夾心ELISA對(duì)表達(dá)的西妥昔單抗進(jìn)行了定量，產(chǎn)量分別為639g/L和522g/L；同時(shí)，我們通過(guò)間接免疫熒光證明了所表達(dá)的西妥昔單抗與EGFR結(jié)合的特異性；并通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)證明了AdC68-CEb和Hu5-CEb顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，而對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有抑制作用；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，用AdC68-CEb和Hu5

在我國(guó)，膀胱癌在泌尿系統(tǒng)腫瘤中占第一位，在經(jīng)濟(jì)、社會(huì)發(fā)展 中造成了嚴(yán)重的損失，危害十分嚴(yán)重。傳統(tǒng)的放、化療存在抗腫瘤能 力低、殺傷指數(shù)過(guò)小、副作用大等缺點(diǎn)。治療效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能令人滿(mǎn)意。 因此，探索新的治療理念、策略和途徑，提高膀胱腫瘤的治療效果， 顯得十分迫切。 腺病毒是理想的腫瘤基因治療和生物治療載體。腺病毒載體由于 具有易于制備高滴度病毒、可感染分裂期和非分裂期細(xì)胞以及不整合 到宿主基因組等優(yōu)點(diǎn)而成為

本發(fā)明的目的是提供一種鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗，即采用生物技術(shù)對(duì)鴨坦布蘇病毒E蛋白進(jìn)行抗原表位分析、拼接，獲得一種鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白DE，并以該融合蛋白作為抗原來(lái)制備鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗。本發(fā)明中鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白DE，其編碼蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO:1；其中一種核苷酸序列為SEQ ID NO:2。本發(fā)明利用pET28a（+）表達(dá)性載體構(gòu)建了能表達(dá)鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白DE的大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌。將重組表達(dá)的蛋白純化后制備成基因工程亞單位疫苗，可使免疫后鴨群獲得免疫保護(hù)。

【發(fā) 明 人】張軍峰；董偉；孟玉芬；詹瑧；何立巍；馬宏躍；馬肖兵 【摘要】 本發(fā)明公開(kāi)了鮮澤漆汁在制備治療單純皰疹病毒藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)篩選，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鮮澤漆汁體外對(duì)單純皰疹病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)具有明顯的抑制作用，并且毒性低，不良反應(yīng)小，且澤漆資源廣泛，易得，成本較低，可持續(xù)開(kāi)發(fā)，應(yīng)用前景廣泛，有望開(kāi)發(fā)成新的抗單純皰疹病毒藥物。

“NMT界喬布斯”許越先生推薦創(chuàng)新平臺(tái) 中關(guān)村NMT產(chǎn)業(yè)聯(lián)盟推介成員單位創(chuàng)新產(chǎn)品 “生物安全，人人有責(zé)” 推出背景： 在國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)白熱化，戰(zhàn)爭(zhēng)形態(tài)多樣化的今天，生物安全已成為國(guó)家安全的重要組成部分，為積極應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，2019年10月，生物安全法草案于首次提請(qǐng)十三屆全國(guó)人大常委會(huì)第十四次會(huì)議審議。本次新冠肺炎疫情的爆發(fā)，讓各界更加意識(shí)到，生物安全對(duì)于確保國(guó)家安全、保障社會(huì)穩(wěn)定、人民群眾生命安全和身體健康的重要性。 國(guó)家安全就是國(guó)家競(jìng)爭(zhēng)，歸根結(jié)底又是科技實(shí)力的競(jìng)爭(zhēng)！因此，作為中國(guó)的高新技術(shù)企業(yè)，中關(guān)村NMT聯(lián)盟的會(huì)員單位，旭月（北京）科技有限公司利用20多年的技術(shù)積累，以NMT：非損傷微測(cè)技術(shù)為底層核心技術(shù)，迅速推出了與國(guó)家生物安全相關(guān)多種檢驗(yàn)，監(jiān)測(cè)儀器設(shè)備，以及適用于多個(gè)學(xué)科及領(lǐng)域的研發(fā)平臺(tái)： 《NMT生物安全創(chuàng)新平臺(tái)》特制系列產(chǎn)品！ ? 應(yīng)對(duì)挑戰(zhàn)： 1）安全性：NMT是用于研究活體材料的生理環(huán)境，其所檢測(cè)的Na+、H+、K+、Cl-等與細(xì)胞能量代謝、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞形態(tài)維持等生理過(guò)程直接相關(guān)。 2）有效性：NMT可實(shí)現(xiàn)活體組織層面研究，結(jié)果更貼近體內(nèi)的真實(shí)藥效結(jié)果。 3）耐藥性：耐藥性的重要機(jī)制之一，是病毒改變了其所處的微環(huán)境，影響藥物發(fā)揮作用，而組成微環(huán)境的pH（H+）及相關(guān)Ca2+信號(hào)，正是非損傷微測(cè)技術(shù)研究的對(duì)象。 分類(lèi)及用途： 1）《高通量抗菌藥NMT篩選儀》（型號(hào)：NMT-HABS-100） 基于底層核心NMT技術(shù)，以及成熟的技術(shù)解決方案，讓科研人員可以馬上投入相關(guān)科研創(chuàng)新工作。 ? 2）《高通量抗菌藥NMT篩選儀》（型號(hào)：NMT-HABS-200） 基于底層核心NMT技術(shù)，結(jié)合自身科研興趣，以及其它相關(guān)技術(shù)參數(shù)，在我方技術(shù)人員協(xié)助下形成技術(shù)解決方案，讓科研人員建立更具獨(dú)有創(chuàng)新特色的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。 ? 《高通量抗菌藥NMT篩選儀》（型號(hào)：NMT-HABS-100） 應(yīng)對(duì)挑戰(zhàn)： 1）安全性：NMT是用于研究活體材料的生理環(huán)境，其所檢測(cè)的Na+、H+、K+、Cl-等與細(xì)胞能量代謝、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞形態(tài)維持等生理過(guò)程直接相關(guān)。 2）有效性：NMT可實(shí)現(xiàn)活體組織層面研究，結(jié)果更貼近體內(nèi)的真實(shí)藥效結(jié)果。 3）耐藥性：耐藥性的重要機(jī)制之一，是病毒改變了其所處的微環(huán)境，影響藥物發(fā)揮作用,而組成微環(huán)境的pH（H+）及相關(guān)Ca2+信號(hào)，正是非損傷微測(cè)技術(shù)研究對(duì)象。 用途： 基于底層核心NMT技術(shù)，以及成熟的技術(shù)解決方案，讓科研人員可以馬上投入相關(guān)科研創(chuàng)新工作。 ? 參數(shù)： 1.基本功能： 1.1針對(duì)抗菌藥物快速篩選設(shè)計(jì) 1.2活體、原位、非損傷檢測(cè) 1.3可檢測(cè)指標(biāo)：H+、K+、Na+、Ca2+、Cl-、O2、H2O2 1.4 可支持96孔板檢測(cè) 2.性能： 2.1自動(dòng)化操作 2.2長(zhǎng)時(shí)間實(shí)時(shí)和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè) 2.3無(wú)需標(biāo)記 2.4立體3D流速檢測(cè) 3.軟件： 3.1imFluxes智能軟件，可直接檢測(cè)、輸出離子分子的濃度與流速 《高通量抗菌藥NMT篩選儀》（型號(hào)：NMT-HABS-200） 應(yīng)對(duì)挑戰(zhàn)： 1）安全性：NMT是用于研究活體材料的生理環(huán)境，其所檢測(cè)的Na+、H+、K+、Cl-等與細(xì)胞能量代謝、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞形態(tài)維持等生理過(guò)程直接相關(guān)。 2）有效性：NMT可實(shí)現(xiàn)活體組織層面研究，結(jié)果更貼近體內(nèi)的真實(shí)藥效結(jié)果。 3）耐藥性：耐藥性的重要機(jī)制之一，是病毒改變了其所處的微環(huán)境，影響藥物發(fā)揮作用,而組成微環(huán)境的pH（H+）及相關(guān)Ca2+信號(hào)，正是非損傷微測(cè)技術(shù)研究對(duì)象。 用途： 基于底層核心NMT技術(shù)，結(jié)合自身科研興趣，以及其它相關(guān)技術(shù)參數(shù)，在我方技術(shù)人員協(xié)助下形成技術(shù)解決方案，讓科研人員建立更具獨(dú)有創(chuàng)新特色的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。 ? 參數(shù)： 1.基本功能： 1.1針對(duì)抗菌藥物快速篩選設(shè)計(jì) 1.2活體、原位、非損傷檢測(cè) 1.3可檢測(cè)指標(biāo)：H+、K+、Na+、Ca2+、Cl-、O2、H2O2 1.4可支持96孔板檢測(cè) 1.5可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和記錄檢測(cè)時(shí)的環(huán)境參數(shù)：溫度、濕度、大氣壓、海拔、經(jīng)緯度 1.6配備新指標(biāo)拓展功能 2.性能： 2.1自動(dòng)化操作 2.2長(zhǎng)時(shí)間實(shí)時(shí)和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè) 2.3無(wú)需標(biāo)記 2.4立體3D流速檢測(cè) 3.軟件： 3.1imFluxes智能軟件，可直接檢測(cè)、輸出離子分子的濃度與流速，以及檢測(cè)時(shí)的環(huán)境參數(shù)