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本發(fā)明公開一種制備熱穩(wěn)定疫苗的方法，特別涉及一種聯(lián)合使用基因工程和仿生礦化技術(shù)制備熱穩(wěn)定疫苗的方法。本發(fā)明提供一種利用基因工程技術(shù)在疫苗表面引入具有誘導(dǎo)無機物礦化能力的多肽的方法；(1)構(gòu)建疫苗的基因克?。?2)將多肽的核酸序列插入疫苗基因克隆中，得到重組克??；(3)將重組克隆在細(xì)胞或大腸桿菌內(nèi)表達(dá)，得到具有自礦化能力的疫苗。本發(fā)明還一種制備鈣礦化上述制得的具有自礦化能力的疫苗的方法；(1)向有酸根的疫苗液加入Ca2+離子；(2)將體系進(jìn)行孵育，獲得磷酸鈣包被疫苗。本發(fā)明通過疫苗礦化，高效地解決了疫苗運輸和保存中的熱失活現(xiàn)象，顯著降低疫苗的財政支出，在新型熱穩(wěn)定疫苗生產(chǎn)中有很好的應(yīng)用。

通過比較基因組和進(jìn)化基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)：Aigarchaeota和Thaumarchaeota由共同祖先分化形成，其祖先早期共同生存于高溫環(huán)境中，至今生存于高溫?zé)崛械腡haumarchaeota與Aigarchaeota仍呈現(xiàn)較高的功能相似性。它們的共同祖先共享1154個基因家族，其數(shù)目甚至超過現(xiàn)存Aigarchaeota基因家族數(shù)目，表明二者祖先的高度相似性。廣為人知的Thaumarchaeota早期并無氨氧化能力，而是后期于高溫生境中進(jìn)化所得，隨后Thaumarchaeota擴散至海洋生境中，由于海洋生境中氮源的匱乏，因此Thaumarchaeota展現(xiàn)出獨特的競爭優(yōu)勢，而被保留于海洋生境中，從而實現(xiàn)高溫氨氧化古菌向中溫環(huán)境的轉(zhuǎn)變。       本研究通過重構(gòu)未培養(yǎng)古菌類群Aigarchaeota基因組信息，揭示其潛在的代謝潛能及其遺傳多樣性獲得機制，并結(jié)合數(shù)據(jù)庫中已有Thaumarchaeota和Aigarchaeota基因組進(jìn)行比較基因組學(xué)和進(jìn)化基因組學(xué)分析，勾勒出這兩個近緣支系的演化歷史場景，指出古菌類群 Thaumarchaeota和Aigarchaeota的共同祖先起源于高溫生境，頻繁的水平基因轉(zhuǎn)移極大地提升了兩者對各自生境的適應(yīng)性，該研究極大地促進(jìn)了我們對古老且神秘的古菌支系的認(rèn)知。

        對于難降解工業(yè)廢水的處理，單獨催化臭氧氧化技術(shù)存在臭氧劑量大、氣體回收難、出水毒性高等問題，而單獨生物降解處理難降解有機廢水周期長、設(shè)備成本高。催化臭氧氧化與微生物降解近場耦合工藝則將按序進(jìn)行的催化氧化裝置和生物掛膜裝置兩個處理單元合并，利用催化臭氧技術(shù)提高難降解有機廢水的可生化性，同時采用生物膜技術(shù)減少后續(xù)處理成本，能夠?qū)崿F(xiàn)低成本提高COD、色度和濁度去除率的效果，同時降低出水毒性，減少環(huán)境生物風(fēng)險。

研發(fā)階段/n口蹄疫（FMD）是引起的人及偶蹄動物共患的一種烈急性、高度接觸性、發(fā)熱性傳染病。FMD在世界上許多國家流行，造成重大的經(jīng)濟損失和政治影響?？谔阋卟《荆‵MDV）屬于小RNA病毒科（Picornaviridae），口蹄疫病毒屬（Aphthovirus），該病毒為單股正鏈小RNA病毒，基因組長約8500個核苷酸，主要由結(jié)構(gòu)基因（P1區(qū)）和非結(jié)構(gòu)基因（P2、P3區(qū)）等構(gòu)成。該發(fā)明具體涉及一種新的含有口蹄疫病毒主要免疫原性基因的重組偽狂犬病弱毒疫苗株，該毒株屬于豬偽狂犬病毒：Pseudorabi

1. 痛點問題 紅球菌是具有高抗逆性（耐有機溶劑、耐高溫、耐酸堿）的特殊放線菌，日本30年前首先使用紅球菌高效催化丙烯腈水合生產(chǎn)丙烯酰胺——其聚合產(chǎn)物廣泛用于石油開采、水處理、土壤改良劑等領(lǐng)域——迄今為止仍是工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域最成功的案例之一。開發(fā)紅球菌基因編輯方法，一方面可以實現(xiàn)紅球菌細(xì)胞自身性能的按需調(diào)控（如敲除副產(chǎn)物基因），解決丙烯酰胺、丙烯酸銨等酰胺、羧酸類大宗/精細(xì)化學(xué)品生產(chǎn)中的高成本和高排放問題，另一方面有望以紅球菌細(xì)胞為普適性宿主，高表達(dá)各種外源功能酶，從而實現(xiàn)重組紅球菌全細(xì)胞催化技術(shù)的普遍應(yīng)用，尤其是解決手性醫(yī)藥中間體現(xiàn)有制備工藝中路線長、工藝復(fù)雜、原子經(jīng)濟性差、環(huán)境污染嚴(yán)重等各種主要問題。但是，作為一種革蘭氏陽性放線菌，紅色紅球菌存在基因組中GC含量高、基因轉(zhuǎn)化率低、非法重組嚴(yán)重等問題，基因組改造困難。目前紅色紅球菌基因組改造主要依賴于自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組，但自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率和單交換成功率很低，正確編輯率更低。因此，迫切需要開發(fā)高效的紅球菌基因組編輯工具。 2. 解決方案 本技術(shù)核心成果是一種基于CRISPR（成簇規(guī)律間隔短回文序列）-Cas9（DNA剪切蛋白）技術(shù)的紅色紅球菌基因組高效編輯方法。該技術(shù)通過紅色紅球菌特有啟動子及質(zhì)粒元件，首先實現(xiàn)了Cas9蛋白在紅色紅球菌中的表達(dá)及切割功能；其次成功規(guī)避了紅球菌的限制修飾系統(tǒng)，將紅色紅球菌基因轉(zhuǎn)化效率提高了80多倍；接下來，又通過紅球菌重組酶的引入，顯著提高了外源基因在紅色紅球菌中的同源重組效率，最終率先成功建立紅色紅球菌的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，不僅可以實現(xiàn)基因組上目標(biāo)基因的敲除、替換和改造，也可實現(xiàn)多個基因的同時敲除以及無痕疊加敲除，為紅球菌全細(xì)胞催化平臺技術(shù)開發(fā)及其在化學(xué)品綠色先進(jìn)制造中的應(yīng)用奠定了堅實基礎(chǔ)。 合作需求 開展合作開發(fā)、技術(shù)許可等，尋求有志于生物制藥、生物合成、石油開采、日化洗滌等不同應(yīng)用領(lǐng)域進(jìn)行紅球菌全細(xì)胞催化法生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)品的企業(yè)合作，尤其是在上述不同領(lǐng)域具有生產(chǎn)和銷售優(yōu)勢或經(jīng)驗的企業(yè)。

重金屬、有毒有機物排放入海后,被海洋生物吸收并隨食物鏈積累與放大,嚴(yán)重?fù)p害海產(chǎn)品的質(zhì)量,威脅生態(tài)環(huán)境與人類健康。因此,開展室內(nèi)養(yǎng)殖海水主要污染重金屬、有機物的有效凈化技術(shù)研究,對于提高養(yǎng)殖海水環(huán)境質(zhì)量和保證水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義。 本文針對室內(nèi)養(yǎng)殖海水污染特點和海水高復(fù)雜體系對重金屬測定的化學(xué)干擾問題,研究和建立了測定重金屬離子新方法;從海水中篩選出耐重金屬離子的細(xì)菌,借助現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對微生物進(jìn)行研究;用海藻酸鈉和四氧化三鈷固定化,進(jìn)行室內(nèi)養(yǎng)殖海水中重金屬吸附和有機物去除研究。借助XPS、XRD、FTIR、SEM等手段研究了海水中重金屬離子去除機理。

選育高產(chǎn)菌種和發(fā)展賴氨酸生產(chǎn)對于提高食品中蛋白質(zhì) 利用率,增強人民體質(zhì)以及發(fā)展家禽飼養(yǎng)業(yè)等具有十分重要的意義,對于以谷物為主要食物的我國尤為重要。本實驗室通過誘變選育和基因工程手段對大腸桿菌進(jìn)行改造，獲得一株高產(chǎn)賴氨酸生產(chǎn)菌株，發(fā)酵培養(yǎng) 36 h，賴氨酸鹽酸鹽產(chǎn)量高達(dá) 193 g/L，葡萄 糖得率為 74%左右。 關(guān)鍵技術(shù) (1)本研究以玉米漿為氮源，有效的降低了發(fā)酵成本； (2)以葡萄糖為原料生產(chǎn) L-脯氨酸的高轉(zhuǎn)化率發(fā)酵，該法綠色、環(huán)保、可持續(xù)，具有經(jīng)濟競爭力，有很好的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用前景； (3)以大腸桿菌為宿主，不僅縮短了發(fā)酵周期，而且也降低了染菌幾率。 

通過基因工程手段，構(gòu)建了高產(chǎn) L-天冬氨酸酶和 L-天冬氨酸-α-脫羧酶共表達(dá)重組菌株。主要技術(shù)指標(biāo)： 在轉(zhuǎn)化體系中，濕菌體添加量 20 g/L，底物 富馬酸 158.0 g/L，轉(zhuǎn)化周期 12~14 h，β-丙氨酸產(chǎn)量 118.6 g/L，底物摩爾轉(zhuǎn)化率 98%；(2) 濕菌體添加量 30 g/L，底物富馬酸 216.0 g/L，轉(zhuǎn)化 12~14 h，β-丙氨酸產(chǎn)量 162.1 g/L，底物摩爾轉(zhuǎn)化率 98%。 關(guān)鍵技術(shù) 以大腸桿菌為宿主，生長快，周期短，催化效率高；(2)以廉價的富馬酸為底物生產(chǎn)高附加值β-丙氨酸，成本低，收益高；(3)微生物轉(zhuǎn)化具有專一性強、條件溫和的優(yōu)點，該法綠色、環(huán)保、可持續(xù)，具有經(jīng)濟競爭力，有很好的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用前景。 

L-纈氨酸是生命有機體的重要組成部分，在生命體內(nèi)物質(zhì)代謝調(diào)控和信息傳遞等許多方面扮演著重要角色。L-纈氨酸屬于八種必需氨基酸之一，也是三種支鏈氨基酸之一。L-纈氨酸發(fā)酵是典型的代謝控制發(fā)酵。國內(nèi)雖有天然蛋白質(zhì)水解液分離提取 L-纈氨酸的產(chǎn)品，但由于其產(chǎn)量很低，質(zhì)量不佳，純度不高，所以無法實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn) L-纈氨酸具有原料成本低，反應(yīng)條件溫和及易實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點，是一種非常經(jīng)濟的生產(chǎn)方法。但是， 以微生物發(fā)酵法生產(chǎn) L-纈氨酸，國內(nèi)大多數(shù)菌株的產(chǎn)酸水平不高，特別是 L-纈氨酸的生產(chǎn)水平和產(chǎn)量遠(yuǎn)不能滿足國內(nèi)市場的需求。因此，開展發(fā)酵法生產(chǎn) L-纈氨酸的研究具有極其重要的意義。本研究室通過高通量篩選策略，獲得一株高產(chǎn)纈氨酸的黃色短桿菌。 

成果描述：借助白酒微生態(tài)研究構(gòu)建的白酒菌種庫及信息資源庫，運用現(xiàn)代生物工程技術(shù)實現(xiàn)傳統(tǒng)釀酒工藝中廢棄物資源的高效利用。將傳統(tǒng)制曲工藝與復(fù)合酶、復(fù)合酵母配合技術(shù)相結(jié)合，精心制作而成的具有較高的產(chǎn)酯能力和出酒率的丟糟專用釀酒微生物制劑?？梢蕴岣咴牧侠寐?、增加酒糟單細(xì)胞蛋白、消化性酶、有機性礦物質(zhì)的含量等。市場前景分析：可應(yīng)用于食品加工、釀造或發(fā)酵產(chǎn)品生產(chǎn)企業(yè)。產(chǎn)品有良好的市場前景。與同類成果相比的優(yōu)勢分析：白酒丟糟專用的釀酒微生物制劑，為淺褐色粉粒，含高活性釀酒酶類和多種生香酵母，每噸酒渣可再產(chǎn)50度酒20kg。年產(chǎn)300噸，年銷售收入300萬元。