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本發(fā)明涉及一種結(jié)合胰島素樣生長因子C結(jié)構(gòu)域多肽(IGF-1C)的殼聚糖水凝膠，其具有良好的細(xì)胞相容性和生物活性。這類活性水凝膠具有可注射性，能夠作為載體材料，促進(jìn)干細(xì)胞對(duì)組織損傷的治療效果。其為移植干細(xì)胞提供適宜的組織再生微環(huán)境，從而提高移植干細(xì)胞的存活率。增加干細(xì)胞在損傷區(qū)內(nèi)的存活及駐留，促進(jìn)移植細(xì)胞存活、增殖，減少凋亡，促進(jìn)損傷部位血管新生以及功能恢復(fù)，進(jìn)而提高干細(xì)胞移植治療組織損傷的治療效果。此外，移植后水凝膠并沒有促進(jìn)干細(xì)胞發(fā)生不良分化。

神經(jīng)遞質(zhì)作為神經(jīng)元與神經(jīng)元及神經(jīng)元與細(xì)胞之間溝通的媒介分子，介導(dǎo)了發(fā)育、信息感知，運(yùn)動(dòng)及大腦的高級(jí)認(rèn)知功能。隨著生化分離純化技術(shù)的發(fā)展以及人們對(duì)大腦精細(xì)結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步了解，現(xiàn)如今已發(fā)現(xiàn)有幾十種重要的神經(jīng)遞質(zhì)。而神經(jīng)系統(tǒng)在時(shí)間和空間上的高度復(fù)雜性對(duì)研究特定神經(jīng)遞質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化及其功能提出了極大的挑戰(zhàn)。本項(xiàng)目成功構(gòu)建了一系列新型的基因編碼的神經(jīng)遞質(zhì)熒光探針，可實(shí)現(xiàn)對(duì)特定神經(jīng)遞質(zhì)動(dòng)態(tài)變化的靈敏檢測(cè)。該類熒光探針利用大多數(shù)已知的神經(jīng)遞質(zhì)所對(duì)應(yīng)的特異性G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）與循環(huán)重排的熒光蛋白（cpGFP）融合，利用循環(huán)重排熒光蛋白的熒光強(qiáng)度變化來指示GPCR的激活，進(jìn)而反應(yīng)外源神經(jīng)遞質(zhì)的濃度變化（圖一）。我們命名該類熒光探針為GRAB探針，即為GPCR Activation Based Sensor的縮寫。

其他成果/n一種酶法制備有機(jī)菜籽多肽的方法，包括：菜籽蛋白的制備；將菜籽蛋白與蒸餾水按一定料液比混勻，并進(jìn)行超聲輔助濕熱處理，得到濕熱菜籽蛋白漿液；向濕熱菜籽蛋白漿液中加入三聚磷酸鈉進(jìn)行超聲輔助磷酸化處理，得到磷酸化菜籽蛋白漿液；調(diào)節(jié)磷酸化菜籽蛋白漿液的pH和溫度，并加入堿性蛋白酶進(jìn)行超聲輔助酶解，得到一次酶解液；調(diào)節(jié)一次酶解液的pH和溫度，并加入復(fù)合風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行超聲輔助酶解，得到二次酶解液；對(duì)二次酶解液進(jìn)行微波滅酶處理，得到滅酶酶解液，將滅酶酶解液離心得到菜籽多肽清液，再進(jìn)行冷凍干燥處理，即得成品的有機(jī)菜籽多肽。該酶法制備有機(jī)菜籽多肽的方法，工藝安全、制備便捷。

其他成果/n種牛骨膠原多肽的生產(chǎn)方法，包括如下步驟：將牛骨膠原蛋白溶液與磷酸鹽溶液混勻，并加熱一定時(shí)間，得到牛骨膠原蛋白漿液；通入交流電流處理一定時(shí)間，切斷電源后再通入恒壓反向電流處理一定時(shí)間，切斷電源后再通入恒壓正向電流處理一定時(shí)間，得到牛骨膠原蛋白混合液；對(duì)牛骨膠原蛋白混合液加入一次復(fù)合酶進(jìn)行超聲輔助酶解，得到一次酶解液；再加入二次復(fù)合酶進(jìn)行超聲輔助酶解，得到二次酶解液；再進(jìn)行微波滅酶處理，將滅酶酶解液靜置冷卻，離心取上清液后再進(jìn)行冷凍干燥處理，即得成品的牛骨膠原多肽。該牛骨膠原多肽的生產(chǎn)方法，

本發(fā)明提供了一種單鏈片段抗體-多肽融合蛋白及其應(yīng)用,該蛋白是一種具有結(jié)合 Her2受體和攜帶抗癌siRNA藥物雙向功能的融合蛋白,可以作為抗癌siRNA的藥物 載體。其中,單鏈片段抗體為Her2-ScFv,多肽為魚精蛋白片段多肽。該單鏈片段抗 體-多肽融合蛋白的序列如SEQ ID NO.1所示的序列。本發(fā)明構(gòu)建的Her2單鏈片段抗 體與魚精多肽的融合蛋白具有結(jié)合Her2受體和攜帶抗癌siRNA藥物的雙向功能。本 發(fā)明的融合蛋白能把抗癌siRNA藥物定向?qū)肽繕?biāo)癌細(xì)胞中,開發(fā)了非病毒載體工 具,加速RNAi技術(shù)應(yīng)用于臨床。

項(xiàng)目成果/簡介:本發(fā)明提供了一種單鏈片段抗體-多肽融合蛋白及其應(yīng)用,該蛋白是一種具有結(jié)合 Her2受體和攜帶抗癌siRNA藥物雙向功能的融合蛋白,可以作為抗癌siRNA的藥物 載體。其中,單鏈片段抗體為Her2-ScFv,多肽為魚精蛋白片段多肽。該單鏈片段抗 體-多肽融合蛋白的序列如SEQ ID NO.1所示的序列。本發(fā)明構(gòu)建的Her2單鏈片段抗 體與魚精多肽的融合蛋白具有結(jié)合Her2受體和攜帶抗癌siRNA藥物的雙向功能。本 發(fā)明的融合蛋白能把抗癌siRNA藥物定向?qū)肽繕?biāo)癌細(xì)胞中,開發(fā)了非病毒載體工 具,加速RNAi技術(shù)應(yīng)用于臨床。項(xiàng)目階段:成果已轉(zhuǎn)化

多肽水凝膠具有生物相容性高、可降解、具有生物活性等特點(diǎn)和 優(yōu)點(diǎn)，它在生長因子和藥物的緩控釋、組織工程和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具 有很高的應(yīng)用前景。目前有較高轉(zhuǎn)化前景的項(xiàng)目是多肽水凝膠在疫苗 佐劑和抗體制備方面的應(yīng)用。癌癥、艾滋病、丙肝等重大疾病疫苗的 研制具有重要的意義。在這些疾病的預(yù)防性和治療性疫苗研制中，關(guān) 鍵的一環(huán)是可激活人體細(xì)胞免疫的佐劑的發(fā)現(xiàn)。 本項(xiàng)目開發(fā)出一種多肽水凝膠，具有極強(qiáng)地激發(fā)細(xì)胞免疫的功能。 對(duì)比于現(xiàn)有的幾種可激活細(xì)胞免疫的佐劑（CpG，MPL 等），我們的 水凝膠佐劑具有以下優(yōu)勢(shì)： 1）成本低，1mgCpG 價(jià)格為 5000-8000rmb，1mgMPL 價(jià)格為 2000- 4000rmb，我們的短肽實(shí)驗(yàn)室合成成本 1g 低于 500rmb； 2）操作簡單，僅需物理混合就可實(shí)現(xiàn)與抗原復(fù)合； 3）適用于蛋白、短肽、DNA、滅活癌細(xì)胞等各類抗原，通用性 高； 4）短肽結(jié)構(gòu)簡單，可大量制備，實(shí)驗(yàn)室一天內(nèi)一次性即可合成10g 以上該多肽，可用于制備 10000 瓶以上 1mL 的水凝膠（臨床用的 疫苗每次注射量是 0.5-1mL），可以很容易的實(shí)現(xiàn)中試級(jí)別的化合物 合成及疫苗制備。基于這些優(yōu)點(diǎn)，該佐劑具有極強(qiáng)的應(yīng)用前景，該研 究獲得科技部重大國際合作項(xiàng)目資助。 由于本項(xiàng)目的水凝膠可制備短肽抗原的抗體，它在抗體定制中具 有極高的應(yīng)用前景。目前抗體制備的技術(shù)為第一步將短肽連接到載體 蛋白 BSA、KLH 等上，然后打動(dòng)物 6-10 周。現(xiàn)有技術(shù)操作復(fù)雜（需 偶聯(lián)蛋白）、耗時(shí)長（6-10 周），而且很多時(shí)候還未能產(chǎn)生有效的抗體。 我們想發(fā)展的技術(shù)相比于現(xiàn)有技術(shù)來說具有明顯的優(yōu)勢(shì)：操作簡單， 僅需物理混合短肽抗原；抗體產(chǎn)生迅速，4-6 周即能生成抗體；抗體 滴度高，由于無需使用載體蛋白，短肽的特異性抗體滴度更高；對(duì)于 磷酸化抗體來說，本項(xiàng)目的水凝膠能減少磷酸化短肽被體內(nèi)磷酸酶去 磷酸化，從而提高磷酸化短肽抗體的比例。 

其他成果/n一種金槍魚骨膠原多肽的制備方法，包括如下步驟：將金槍魚骨蛋白與蒸餾水混勻，并進(jìn)行加熱加壓處理，得到金槍魚骨蛋白漿液；調(diào)節(jié)金槍魚骨蛋白漿液pH，并加入木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，得到酶解液；將酶解液滅酶得到滅酶酶解液；將滅酶酶解液靜置冷卻，離心取上清液后再進(jìn)行超濾處理，得膠原多肽粗液；將膠原多肽粗液依次加入到陰離子交換樹脂層析柱中洗脫，葡聚糖凝膠柱層析中洗脫，采用高效液相色譜進(jìn)行純化處理，即得金槍魚骨膠原多肽。該金槍魚骨膠原多肽的制備方法，工藝安全、制備便捷。

據(jù)2020年全球癌癥數(shù)據(jù)報(bào)告統(tǒng)計(jì)，2020年中國癌癥新發(fā)病例前十的癌癥分別是：肺癌 82萬，結(jié)直腸癌 56 萬，胃癌 48萬，乳腺癌 42萬，肝癌 41萬，食管癌 32萬，甲狀腺癌22萬，胰腺癌 12萬，前列腺癌12萬，宮頸癌11萬，這十種癌癥占新發(fā)癌癥數(shù)的78%；2020 年中國癌癥死亡人數(shù)前十的癌癥分別是：肺癌 71萬，肝癌 39萬，胃癌 37萬，食管癌 30萬，結(jié)直腸癌 29萬，胰腺癌 12萬，乳腺癌 12萬，神經(jīng)系統(tǒng)癌癥 7萬，白血病 6萬，宮頸癌 6萬，這十種癌癥占癌癥死亡總數(shù)的83%。 2020年中國癌癥死亡例數(shù)前十的癌癥類型 肝癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是常見惡性腫瘤之一，2020年在我國其發(fā)病率位居第五位，死亡率高居第二位。由于其早期癥狀不易被發(fā)現(xiàn)且發(fā)展迅速等特點(diǎn)，使得大多數(shù)患者在被確診時(shí)就己經(jīng)喪失了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)。因此，化療成為患者治療選擇的重要手段。鉑(II)類抗癌藥物如順鉑、卡鉑和奧沙利鉑對(duì)肝癌療效確切，在臨床上常與其他抗癌藥物聯(lián)合治療肝癌，但其仍然存在靶向性差、嚴(yán)重的毒副作用和耐藥性等缺點(diǎn)。因此，探索具有肝靶向性強(qiáng)、療效高和毒性低的鉑類抗癌藥物已成為新一代鉑類抗肝癌藥物研究中擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題。 研究表明，在肝細(xì)胞表面鑲嵌著豐富的甘草次酸（Glycyrrhetinic acid，GA）特異性結(jié)合位點(diǎn)，且該位點(diǎn)與GA具有高度飽和性和親和性。經(jīng)后期研究發(fā)現(xiàn)GA受體是蛋白激酶Ca，其在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)遠(yuǎn)高于其他細(xì)胞，且GA自身還具有抗肝炎和保肝的功效。研究表明，GA對(duì)肝癌細(xì)胞增殖具有一定的抑制作用，可以通過多種作用機(jī)制殺傷肝癌細(xì)胞, 例如周期停滯、自噬和誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡等；另外，GA還可以通過增強(qiáng)肝臟抗氧化能力和抑制炎癥反應(yīng)，起到保肝護(hù)肝的作用。因此，本項(xiàng)目基于鉑(IV)配合物獨(dú)有的化學(xué)與生物性質(zhì)且可以充當(dāng)前藥和GA具有特異性結(jié)合GA受體的特點(diǎn)，我們?cè)O(shè)想將GA受體特異性結(jié)合的藥物分子GA與鉑(IV)配合物相結(jié)合構(gòu)建的雙藥給藥體系，一方面可以將鉑類抗癌藥物遞送到腫瘤部位，以增加藥物在靶細(xì)胞、靶組織或靶器官之中的濃度，進(jìn)而起到靶向性治療和降低毒性的目的，為開發(fā)靶向肝癌細(xì)胞的鉑類抗癌藥物提供一種新的思路和方法。 本項(xiàng)目實(shí)施的技術(shù)路線圖 本項(xiàng)目立足生物醫(yī)藥領(lǐng)域鉑類抗腫瘤藥物的篩選及工藝開發(fā)，應(yīng)用于肝癌患者的治療，其原料易得，工藝綠色，成本低，科技含量高、應(yīng)用前景大。相關(guān)研究已獲國家自然科學(xué)基金-青年科學(xué)基金（22007036）、中國博士后科學(xué)基金-面上項(xiàng)目（2020M673553XB）和淮安市2020“淮上英才”駐淮高校優(yōu)秀博士等項(xiàng)目資助。近年來，在鉑類抗癌藥物及小分子抗癌藥物領(lǐng)域，以第一作者、共同第一作者及通訊作者在Cancer Letters、Journal of Medicinal Chemistry、European Journal of Medicinal Chemistry 、Bioconjugate Chemistry、Bioorganic & Medicinal Chemistry、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters、Journal of Materials Chemistry B、Bioorganic Chemistry等國際知名藥物期刊發(fā)表SCI論文20余篇。這些研究成果為本產(chǎn)品的開發(fā)和宣傳推廣奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 本項(xiàng)目圍繞GA受體介導(dǎo)肝靶向，構(gòu)建系列靶向肝癌細(xì)胞的鉑(IV)類抗腫瘤配合物，使其可以形成具有主動(dòng)靶向和多靶點(diǎn)作用的多功能鉑(IV)配合物前藥分子，并希望從中篩選出具有抗癌活性高、靶向性強(qiáng)和毒性低的新型鉑(IV)抗腫瘤配合物。目前相關(guān)產(chǎn)品還處在實(shí)驗(yàn)室研發(fā)階段，根據(jù)擬設(shè)計(jì)的項(xiàng)目合成路線，已合成出了最終目標(biāo)化合物。體外抗癌活性結(jié)果表明，目標(biāo)化合物對(duì)肝癌細(xì)胞系如HepG2、SMMC-7721、 Bel-7402 和 Bel-7404具有良好的抗癌活性且優(yōu)于陽性藥物順鉑，且對(duì)正常的肝細(xì)胞HL-7702和LO2毒性較低。另外，相關(guān)的抗腫瘤作用機(jī)制和工藝路線的優(yōu)化研究正在進(jìn)行中。基于目前的研究結(jié)果來看，本課題的開發(fā)及應(yīng)用具有重要的學(xué)術(shù)意義和應(yīng)用前景。 本項(xiàng)目依托單位為淮陰工學(xué)院及其下屬的江蘇省特色資源開發(fā)與藥用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。相關(guān)成果為本團(tuán)隊(duì)獨(dú)立研發(fā)，知識(shí)產(chǎn)權(quán)清晰。項(xiàng)目可以技術(shù)轉(zhuǎn)讓、技術(shù)入股、合作開發(fā)及技術(shù)服務(wù)等多種方式轉(zhuǎn)化。

1. 痛點(diǎn)問題 Wnt/β-catenin信號(hào)通路的持續(xù)激活會(huì)導(dǎo)致多種癌癥的發(fā)生發(fā)展，例如結(jié)腸癌、胃癌、肝癌等。通過特異性降解β-catenin來抑制腫瘤中的Wnt信號(hào)被認(rèn)為是一種最直接有效的抗癌策略。過去以β-catenin為靶點(diǎn)的Wnt信號(hào)抑制劑幾乎都是小分子，但小分子抑制劑很難對(duì)β-catenin進(jìn)行徹底的抑制，到目前為止沒有β-catenin的小分子抑制劑被批準(zhǔn)臨床使用。因此，開發(fā)特異性降解β-catenin的新型藥物具有極大的臨床應(yīng)用價(jià)值。 2. 解決方案 本項(xiàng)目采用蛋白降解靶向嵌合PROTAC（Proteolysis-Targeting Chimeras）技術(shù)，將VHL泛素連接酶的配體肽段用化學(xué)合成的方法和訂書肽xStAx連接起來，得到靶向嵌合體多肽xStAx-VHL。該嵌合體多肽能夠持續(xù)穩(wěn)定地降解腸癌細(xì)胞內(nèi)的β-catenin蛋白，從而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)。在小鼠的小腸類器官系統(tǒng)中，xStAx-VHL能夠有效地抑制類器官的存活，xStAx-VHL也能明顯的抑制結(jié)腸癌細(xì)胞在裸鼠皮下的成瘤作用，而且可以顯著減少小鼠結(jié)腸癌模型中的腫瘤數(shù)量。此外，xStAx-VHL可以通過特異性降解β-catenin來影響結(jié)腸癌患者來源的腫瘤類器官的生存。本項(xiàng)目首次報(bào)道了一種利用PROTAC技術(shù)合成的靶向降解β-catenin的嵌合體多肽,不僅可以在細(xì)胞內(nèi)特異性降解β-catenin抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，而且還能在多個(gè)腫瘤模型中抑制細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生發(fā)展。