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一步酶法從頭孢菌素 C（ CPC）生產(chǎn) 7－氨基頭孢烷酸（ 7－ACA）菌株及催化工藝

一步酶法從頭孢菌素 c（CPC）生產(chǎn) 7－氨基頭孢烷酸（ 7-ACA）是繼我們研發(fā)的兩步酶法工藝成功應(yīng)用于工1 成果簡(jiǎn)介一步酶法從頭孢菌素 c（CPC）生產(chǎn) 7－氨基頭孢烷酸（ 7-ACA）是繼我們研發(fā)的兩步酶法工藝成功應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)以后，在生產(chǎn)頭孢菌素類(lèi)抗生素醫(yī)藥中間體技術(shù)的又一個(gè)突破。與化學(xué)法和兩步酶法相比，一步酶法有工藝簡(jiǎn)單、環(huán)保和轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)品質(zhì)量好等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)采用基因工程技術(shù)對(duì) CPC 酰化酶（一步酶法用酶）的基因進(jìn)行了改造，獲得了能夠高效催化 CPC 到 7-ACA 的突變基因。通過(guò)我們自己構(gòu)建的高效啟動(dòng)子 HP 以及優(yōu)化組合的調(diào)控表達(dá)元件，構(gòu)建并篩選出了能夠高效、高活性表達(dá)一步酶法用酶——CPC 酰化酶的基因工程細(xì)胞株。這是國(guó)內(nèi)第一個(gè)使得 CPC ?；富钚阅軌蜻_(dá)到工業(yè)應(yīng)用水平的技術(shù)。由于采用了高效的表達(dá)系統(tǒng)和穩(wěn)定的質(zhì)粒，以及組成型表達(dá)結(jié)構(gòu)，使得該基因工程菌遺傳特性非常穩(wěn)定，在發(fā)酵制酶的過(guò)程中不需要添加任何抗生素和誘導(dǎo)劑就可以實(shí)現(xiàn)高效、高活性表達(dá)。在高效表達(dá) CPC 酰化酶的基礎(chǔ)上，我們通過(guò)在表達(dá)基因上同時(shí)引入的特殊基因序列，使得蛋白的純化和固定化工藝一步進(jìn)行。通過(guò)自己開(kāi)發(fā)研制的可重復(fù)使用的固定化載體，可以使得固定化酶活性達(dá)到 60U/g 以上。采用我們研制的特異性純化介質(zhì)，可以從菌體破碎液中一步純化和固定化 CPC ?；?，酶收率在 90 ％以上，固定化酶活達(dá)到 60U/g 以上。固定化酶可以重復(fù)使用 20 批以上，純化和固定化用載體可以重復(fù)使用。2 技術(shù)指標(biāo)菌種：基因工程大腸桿菌，卡那抗性，組成型表達(dá)。發(fā)酵溫度： 37℃ 培養(yǎng) 基：普通的大腸桿菌培養(yǎng)基，主要成分有玉米漿等廉價(jià)的營(yíng)養(yǎng)源。發(fā)酵周期： 20 小時(shí) 發(fā)酵酶活： 3U/ml 以上（ 5 升發(fā)酵罐）特點(diǎn)：遺傳特性穩(wěn)定，不需要添加誘導(dǎo)劑和抗生素，工藝簡(jiǎn)單。3 合作方式小試技術(shù)轉(zhuǎn)讓或合作進(jìn)行中試。4 所屬行業(yè)領(lǐng)域醫(yī)療衛(wèi)生。業(yè)生產(chǎn)以后，在生產(chǎn)頭孢菌素類(lèi)抗生素醫(yī)藥中間體技術(shù)的又一個(gè)突破。與化學(xué)法和兩步酶法相比，一步酶法有工藝簡(jiǎn)單、環(huán)保和轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)品質(zhì)量好等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)采用基因工程技術(shù)對(duì) CPC ?；福ㄒ徊矫阜ㄓ妹福┑幕蜻M(jìn)行了改造，獲得了能夠高效催化 CPC 到 7-ACA 的突變基因。通過(guò)我們自己構(gòu)建的高效啟動(dòng)子 HP 以及優(yōu)化組合的調(diào)控表達(dá)元件，構(gòu)建并篩選出了能夠高效、高活性表達(dá)一步酶法用酶——CPC ?；傅幕蚬こ碳?xì)胞株。這是國(guó)內(nèi)第一個(gè)使得 CPC ?；富钚阅軌蜻_(dá)到工業(yè)應(yīng)用水平的技術(shù)。由于采用了高效的表達(dá)系統(tǒng)和穩(wěn)定的質(zhì)粒，以及組成型表達(dá)結(jié)構(gòu)，使得該基因工程菌遺傳特性非常穩(wěn)定，在發(fā)酵制酶的過(guò)程中不需要添加任何抗生素和誘導(dǎo)劑就可以實(shí)現(xiàn)高效、高活性表達(dá)。在高效表達(dá) CPC 酰化酶的基礎(chǔ)上，我們通過(guò)在表達(dá)基因上同時(shí)引入的特殊基因序列，使得蛋白的純化和固定化工藝一步進(jìn)行。通過(guò)自己開(kāi)發(fā)研制的可重復(fù)使用的固定化載體，可以使得固定化酶活性達(dá)到 60U/g 以上。采用我們研制的特異性純化介質(zhì)，可以從菌體破碎液中一步純化和固定化 CPC 酰化酶，酶收率在 90 ％以上，固定化酶活達(dá)到 60U/g 以上。固定化酶可以重復(fù)使用 20 批以上，純化和固定化用載體可以重復(fù)使用。

清華大學(xué) 2021-04-13

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