技術(shù)領(lǐng)域：本發(fā)明涉及靶向性多肽，具體涉及一種脂肪組織靶向性多肽-毛蕊花苷-納米金顆粒衍生物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：近年來，由于膳食結(jié)構(gòu)的改變，久坐的工作模式，運(yùn)動(dòng)量減少，生活方式逐漸西方化等因素導(dǎo)致能量過度攝入，使肥胖患者的數(shù)量在我國迅速增加。肥胖是由于能量攝入大于消耗導(dǎo)致白色脂肪（包括內(nèi)臟脂肪、皮下脂肪）在體內(nèi)過度堆積而形成的一種慢性代謝性疾病，它可分為中心性肥胖（也稱腹型肥胖，主要表現(xiàn)為內(nèi)臟脂肪堆積）和單純性肥胖（主要表現(xiàn)為皮下脂肪堆積）兩大類。大量研究發(fā)現(xiàn)，白色脂肪增多導(dǎo)致的肥胖是促進(jìn)胰島素抵抗、2型糖尿病、高血脂癥、高血壓等代謝性疾病發(fā)生的主要原因。此外，肥胖除與代謝性疾病有關(guān)外，還與多種腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展有著緊密的關(guān)系。因此，針對肥胖尤其是靶向白色脂肪的干預(yù)治療是預(yù)防和治療肥胖相關(guān)疾病的重要措施。目前，對于肥胖癥的治療主要有飲食行為療法、外科手術(shù)和藥物治療。對于大多數(shù)肥胖患者來說，減少能量的攝入并增加運(yùn)動(dòng)量可以起到減肥效果，但當(dāng)停止減肥體重會反彈回去，甚至超過了減肥前的體重。而外科手術(shù)（如：縮胃術(shù)、胃旁路手術(shù)、胃束帶手術(shù)）風(fēng)險(xiǎn)太大。因此，許多肥胖患者把藥物治療作為首選，美國FDA批準(zhǔn)了兩種可長期應(yīng)用的減肥藥，分別為西布曲明（Sibutramine）和奧利司他（Orlistat）。但長期使用后，前者可引發(fā)高血壓、失眠等，后者會造成嚴(yán)重的胃腸道副作用，如腹瀉、排泄失禁等，導(dǎo)致用藥受到限制。因此，在參與代謝綜合癥相關(guān)的器官中，如何使得藥物能夠僅僅作用于脂肪組織，卻對其他臟器和組織不造成影響，從而達(dá)到不改變?nèi)梭w免疫系統(tǒng)的基礎(chǔ)上能更高效治療代謝綜合癥的目的，成為現(xiàn)在肥胖治療面臨的重要問題和研究重點(diǎn)。2004年，著名的科學(xué)雜志“Nature Medcine”報(bào)道發(fā)現(xiàn)一多肽能特異性地和白色脂肪組織血管的內(nèi)皮細(xì)胞受體結(jié)合，其氨基酸序列為CKGGRAKDC。中國專利CN102120755A公開了一種棕色脂肪組織靶向性多肽及其應(yīng)用，公開了多肽可以與具有生物藥理活性的物質(zhì)相連接，能夠靶向性運(yùn)送治療性藥物到達(dá)棕色脂肪組織，發(fā)揮藥理學(xué)效應(yīng)，從而達(dá)到靶向治療的目的，側(cè)重于報(bào)道一種棕色脂肪組織靶向性治療的多肽載體，但該靶向性多肽載體的生物兼容性及所載藥物的療效如何還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。
發(fā)明目的：為了解決靶向治療肥胖的問題，本發(fā)明第一方面提供了一種脂肪組織靶向性多肽-毛蕊花苷-納米金顆粒衍生物的制備方法，本發(fā)明第二方面提供了一種脂肪組織靶向性多肽-毛蕊花苷-納米金顆粒衍生物，本發(fā)明第三方面提供了脂肪組織靶向性多肽-毛蕊花苷-納米金顆粒衍生物在制備治療肥胖疾病的藥物中的應(yīng)用。
技術(shù)方案：本發(fā)明所述一種脂肪組織靶向性多肽-毛蕊花苷-納米金顆粒衍生物的制備方法，包括以下步驟：（1）將脂肪組織靶向性多肽C端的半胱氨酸殘基的羧基活化生成酰氯，所述脂肪組織靶向性多肽的氨基酸序列為CKGGRAKDC；（2）將毛蕊花苷和氫氧化鈉反應(yīng)得到酚鈉；（3）將步驟（1）得到的酰氯和步驟（2）得到的酚鈉發(fā)生酯化反應(yīng)生成脂肪組織靶向性多肽-毛蕊花苷衍生物；（4）納米金顆粒進(jìn)行PEG修飾，將步驟（3）得到的脂肪組織靶向性多肽-毛蕊花苷衍生物和PEG修飾的納米金顆粒混合反應(yīng)，其中脂肪組織靶向性多肽C端的半胱氨酸殘基的巰基和納米金通過Au-S鍵連接。步驟（1）中，脂肪組織靶向性多肽的氨基酸序列中各個(gè)字母符號所代表的氨基酸殘基的定義如下：C為半胱氨酸，K為賴氨酸，G為甘氨酸，R為精氨酸，A為丙氨酸，D為天冬氨酸；所述脂肪組織靶向性多肽的第2位和第7位氨基酸殘基的側(cè)鏈連接有氨基保護(hù)基，第5位氨基酸殘基（精氨酸）連接有胍基保護(hù)基，第8位氨基酸殘基連接有羧基保護(hù)基，N端氨基酸殘基連接有巰基保護(hù)基，N端氨基被芐氧甲酰基保護(hù)。優(yōu)選地，所述氨基保護(hù)基為9-芴甲氧羰基（Fmoc），所述胍基保護(hù)基為金剛烷氧羰基（Adoc），羧基保護(hù)基為甲酯，巰基保護(hù)基為三苯甲基。步驟（1）中，將多肽CKGGRAKDC用DMSO溶解，然后將多肽溶液加入到三頸瓶內(nèi)，滴加N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和二氯亞砜，攪拌均勻，70-75℃反應(yīng)1-2 h，獲得酰氯。優(yōu)選地，10 mg多肽CKGGRAKDC（氨基、側(cè)鏈羧基、N端巰基已保護(hù)）用1 mL DMSO溶解，加入到三頸瓶內(nèi)，滴加2-5滴的DMF，觀察溫度計(jì)使瓶內(nèi)溫度控制在25 ℃以下，緩慢滴加3-5 mL二氯亞砜，攪拌均勻。隨后緩慢升溫，于70-75℃反應(yīng)1-2 h，冷卻，獲得酰氯，密封備用。步驟（2）中，將毛蕊花苷與氫氧化鈉分別用甲醇溶解，將徹底溶解的兩種溶液混合，室溫反應(yīng)，生成酚鈉。其中，毛蕊花苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見式Ⅰ，毛蕊花苷和氫氧化鈉的摩爾比為1:4，即NaOH的量足以和毛蕊花苷的4個(gè)酚羥基都發(fā)生反應(yīng)。優(yōu)選地，將0.1 mol毛蕊花苷和0.4 mol氫氧化鈉放入20 mL的甲醇中，充分?jǐn)嚢杈鶆蛑镣耆芙狻ｋS后，將兩種溶液等體積、室溫充分混合反應(yīng)。步驟（3）中，將步驟（2）得到的酚鈉溶解在去離子水中，充分?jǐn)嚢瑁缓笤诘蜏叵戮徛鶆虻渭硬襟E（1）獲得的酰氯，于10-15 ℃攪拌反應(yīng)1.5-2 h，反應(yīng)完全后，清洗、抽濾、壓干，獲得脂肪組織靶向性多肽-毛蕊花苷衍生物。優(yōu)選地，步驟（1）中所述脂肪組織靶向性多肽和步驟（2）中所述毛蕊花苷的摩爾比為1-5:1。步驟（4）中，所述納米金顆粒進(jìn)行PEG修飾的步驟如下：將納米金顆粒與2 mM SH-mPEG-COOH（分子量5000）溶液于20-25 ℃混合，攪拌孵育12-24 h，隨后經(jīng)離心、洗滌3次將未反應(yīng)的SH-mPEG-COOH清除，所得沉淀溶于去離子水中備用；所述脂肪組織靶向性多肽-毛蕊花苷衍生物和PEG修飾的納米金顆粒的摩爾比為106:9-5（摩爾比以毛蕊花苷和納米金的摩爾量確定），反應(yīng)條件為避光過夜搖勻，搖床轉(zhuǎn)速200-250 rpm，溫度20-25 ℃。其中納米金具有抑制肥胖和提高衍生物的生物兼容性的作用。本發(fā)明第二方面提供上述制備方法制備得到的脂肪組織靶向性多肽-毛蕊花苷-納米金顆粒衍生物。本發(fā)明第三方面提供所述脂肪組織靶向性多肽-毛蕊花苷-納米金顆粒衍生物在制備治療肥胖疾病的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述藥物為注射劑。
有益效果：（1）本發(fā)明提供的脂肪組織靶向性多肽-毛蕊花苷-納米金顆粒衍生物，具有良好的生物相容性，可攜帶藥物靶向進(jìn)入脂肪細(xì)胞，大大增強(qiáng)了藥物的可利用率，從而顯著提高了藥物的靶向抗肥胖活性，適用于不同給藥方法如靜脈注射的靶向作用、腹腔、肌肉和皮下注射的緩控釋作用；（2）本發(fā)明所用的材料成本低廉、便于獲取，制備過程簡單快捷，且為常規(guī)反應(yīng)，未破壞藥物本身的性質(zhì)；且本法制備的脂肪組織靶向性多肽-毛蕊花苷-納米金顆粒衍生物性質(zhì)穩(wěn)定，便于保存。