RNA聚合酶II（Pol II）作為真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄核心機(jī)器，主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄編碼蛋白質(zhì)的mRNA和部分非編碼RNA。Pol II在細(xì)胞中并不是均勻分布的，而是在細(xì)胞核中形成大量聚集的簇（cluster），這些簇通常被稱為轉(zhuǎn)錄工廠或者轉(zhuǎn)錄凝聚體。轉(zhuǎn)錄工廠是在1993年由Peter Cook和Luitzen de Jong課題組在RNA聚合酶和新生RNA標(biāo)記成像的實(shí)驗(yàn)中偶然發(fā)現(xiàn)1,2，2012年，Yijun Ruan課題組通過RNA聚合酶的ChIA-PET測(cè)序分析進(jìn)一步確認(rèn)3。2013年，Xavier Darzacq和Ibrahim I.Cissé課題組通過超高分辨顯微成像發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄工廠呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化并且與活細(xì)胞中的RNA生成相關(guān)4。先前的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄工廠能夠介導(dǎo)不同染色質(zhì)位點(diǎn)基因的協(xié)同表達(dá)、增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄效率、組織三維染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，并且可以幫助癌癥中的染色體易位。轉(zhuǎn)錄工廠相關(guān)研究的重要問題之一是并不清楚其關(guān)鍵控制因子。另一方面，基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制研究通常著眼于轉(zhuǎn)錄的起始、延伸和終止的過程研究，對(duì)于是否能夠通過控制轉(zhuǎn)錄工廠實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)操控依然未知。

2022年9月28日，Nature Communications在線發(fā)表了來自北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院季雄研究員課題組題為“The transcriptional coactivator RUVBL2 regulates Pol II clustering with diverse transcription factors”的研究論文。研究者通過多種質(zhì)譜篩選鑒定和多學(xué)科技術(shù)證實(shí)，AAA+家族ATPase分子RUVBL2能夠直接控制活躍啟動(dòng)子附近的Pol II轉(zhuǎn)錄工廠。RUVBL2在多種癌癥中高表達(dá)，與癌癥發(fā)生相關(guān)，是癌癥抑制劑的熱門靶點(diǎn)之一。該研究進(jìn)一步鑒定出RUVBL2-Pol II通路的直接調(diào)控基因，其中包括c-Myc等。相關(guān)工作為理解Pol II轉(zhuǎn)錄工廠提供新型因子，并且也為抗腫瘤靶點(diǎn)應(yīng)用提供新的思路。

論文截圖

Pol II轉(zhuǎn)錄凝聚體調(diào)控因子的鑒定。為尋找鑒定轉(zhuǎn)錄Pol II凝聚體調(diào)控蛋白，研究者首先通過分析轉(zhuǎn)錄機(jī)器相關(guān)因子的染色質(zhì)蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，并結(jié)合組蛋白修飾互作蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，篩選發(fā)現(xiàn)AAA+家族ATPase分子RUVBL2能夠與染色質(zhì)上的Pol II緊密互作。RUVBL2在前人的研究中發(fā)現(xiàn)其主要參與生物大分子復(fù)合體的組裝，能夠發(fā)揮類似于分子伴侶的功能，因此可作為Pol II凝聚體的潛在調(diào)控蛋白。研究者進(jìn)一步捕獲了RUVBL2的染色質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)信息，分析后發(fā)現(xiàn)該蛋白主要與Pol II共定位在基因的活躍啟動(dòng)子。通過特異性Pol II-CTD降解細(xì)胞系及體外純化蛋白的Pulldown實(shí)驗(yàn)證明RUVBL2與非磷酸化的Pol II-CTD直接互作。在細(xì)胞中快速降解RUVBL2蛋白后，細(xì)胞核內(nèi)Pol II凝聚體數(shù)量明顯下降，新生RNA測(cè)序表明細(xì)胞總體轉(zhuǎn)錄水平也明顯下降，說明RUVBL2與Pol II凝聚體及基因轉(zhuǎn)錄活性密切相關(guān)。

RUVBL2分子調(diào)控Pol II凝聚體的機(jī)制。為確證RUVBL2對(duì)轉(zhuǎn)錄起始凝聚體的調(diào)控，研究者在RUVBL2蛋白降解前后對(duì)Pol II及轉(zhuǎn)錄起始因子TBP分別進(jìn)行了活細(xì)胞時(shí)間序列光激活定位顯微鏡（tcPALM）及受激發(fā)射耗損（STED）顯微鏡成像觀察，發(fā)現(xiàn)RUVBL2蛋白的降解可明顯減少瞬時(shí)和穩(wěn)定Pol II的凝聚體，轉(zhuǎn)錄起始因子TBP的凝聚能力也明顯下降。另一方面，將RUVBL2蛋白募集到Lac O啟動(dòng)子區(qū)，在基因被激活的狀態(tài)下可增強(qiáng)該啟動(dòng)子區(qū)域Pol II凝聚體的形成；反之，Pol II-CTD的募集也會(huì)導(dǎo)致RUVBL2的匯聚，說明在細(xì)胞內(nèi)RUVBL2能夠促進(jìn)Pol II的凝聚體的形成。為深入探索其機(jī)制，研究者通過細(xì)胞內(nèi)定點(diǎn)募集、體外微滴實(shí)驗(yàn)及功能區(qū)域截短分析等，發(fā)現(xiàn)RUVBL2與其同家族蛋白R(shí)UVBL1的寡聚能力及ATPase活性對(duì)Pol II凝聚體的形成均具有關(guān)鍵貢獻(xiàn)；體外微滴和DNA窗簾實(shí)驗(yàn)均證實(shí)生理濃度范圍的RUVBL1/2異六聚體可顯著促進(jìn)Pol II-CTD及轉(zhuǎn)錄因子的相分離形成，體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)證明RUVBL1/2可明顯增強(qiáng)經(jīng)典TATA啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始，表明RUVBL2能夠直接促進(jìn)Pol II-CTD與轉(zhuǎn)錄因子的動(dòng)態(tài)互作，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄起始活性。

RUVBL2-Pol II軸的功能。RUVBL2在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，參與復(fù)合體眾多，但RUVBL2的直接靶基因以及基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并不清楚。為探究RUVBL2促進(jìn)Pol II凝聚體形成的功能，研究者應(yīng)用吲哚乙酸介導(dǎo)的快速降解RUVBL2蛋白系統(tǒng)，并對(duì)RUVBL2降解后引起的基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后效應(yīng)進(jìn)行分析。通過整合分析染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序（ChIP-Seq）、時(shí)間序列的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）以及新生轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（PRO-Seq）數(shù)據(jù)，鑒定出45個(gè)在轉(zhuǎn)錄水平上快速響應(yīng)RUVBL2降解的直接靶基因和41個(gè)在轉(zhuǎn)錄后水平快速響應(yīng)RUVBL2降解的即時(shí)響應(yīng)基因。研究者進(jìn)一步通過鑒定多種腫瘤細(xì)胞系中RUVBL2的染色質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，證明了RUVBL2調(diào)控的45個(gè)靶基因在不同細(xì)胞系中的普適性，繪制了以RUVBL2-Pol II為軸的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。應(yīng)用機(jī)器學(xué)習(xí)對(duì)現(xiàn)有染色質(zhì)結(jié)合數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)RUVBL2更廣泛地與多種轉(zhuǎn)錄因子共結(jié)合在活躍基因啟動(dòng)子區(qū)域，可能共同調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)一步提示了RUVBL2通過促進(jìn)Pol II與多種轉(zhuǎn)錄因子形成轉(zhuǎn)錄凝聚體的模式發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能。為此，研究者通過RNA原位雜交結(jié)合免疫熒光實(shí)驗(yàn)（smRNA FISH+IF）在RUVBL2直接靶基因位點(diǎn)也佐證了該模型。

RUVBL1/2基因表達(dá)調(diào)控模型。作為分子伴侶，RUVBL1/2參與復(fù)合體眾多，包括RNA聚合酶的組裝，染色質(zhì)調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后RNA加工相關(guān)復(fù)合體等，先前研究表明，RUVBL1/2在細(xì)胞核中主要與特定轉(zhuǎn)錄因子相互作用發(fā)揮轉(zhuǎn)錄共激活或抑制的功能（灰色箭頭）。本研究主要發(fā)現(xiàn)證明了RUVBL1/2通過直接與Pol II-CTD互作促進(jìn)活躍啟動(dòng)子附近Pol II轉(zhuǎn)錄凝聚體的形成，從而發(fā)揮增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性的功能（藍(lán)色箭頭），多種轉(zhuǎn)錄因子共同參與了該生物學(xué)過程

總之，研究者發(fā)現(xiàn)了RUVBL1/2對(duì)Pol II轉(zhuǎn)錄凝聚體的直接調(diào)控功能，鑒定了RUVBL2-Pol II軸快速應(yīng)答基因，促進(jìn)了對(duì)Pol II、轉(zhuǎn)錄因子互作與轉(zhuǎn)錄相分離調(diào)控機(jī)制關(guān)系的更深入理解；同時(shí)，RUVBL2在眾多腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常，多種抑制劑均具有較好的抗腫瘤效果，本研究將為RUVBL2在腫瘤中調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制及其作為靶點(diǎn)應(yīng)用提供新的思路。

季雄為本論文通訊作者。北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王輝博士、李伯源博士為本論文共同第一作者。北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心鄧伍蘭研究員、定量生物學(xué)中心齊志研究員，清華大學(xué)高軍濤研究員、復(fù)旦大學(xué)徐彥輝教授、中科院生物物理所俞洋和劉超培研究員等為該工作提供了重要幫助。該工作得到科技部國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心和細(xì)胞增殖與分化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的資助。北京大學(xué)鳳凰工程多個(gè)儀器平臺(tái)對(duì)本項(xiàng)目提供了大力支持。

季雄課題組長(zhǎng)期從事RNA聚合酶亞基功能調(diào)控和疾病機(jī)理的研究，主要集中在RNA聚合酶相關(guān)的新型功能、腦部疾病和核酸適配體篩選等方向，近期成果發(fā)表在Molecular Cell、Nature Communications、Genome Biology、Cell Discovery、CMLS和iScience等雜志上，為選擇性基因表達(dá)調(diào)控提供新的假說。