近日，園藝學院果樹逆境生物學團隊管清美課題組在植物學頂級期刊《Plant Cell》在線發表了題為“Methylation of a MITE insertion in the MdRFNR1-1 promoter is positively associated with its allelic expression in apple in response to drought stress”的研究論文。該研究揭示了轉座子MITE-MdRF1通過影響MdRFNR1-1表達進而調控蘋果抗旱的分子機制。轉座子（Transposable element,TE）廣泛分布于真核生物基因組中，是一種可移動的DNA單元，通常情況處于沉默狀態以維持基因組的穩定性。為了抑制其轉座活性，宿主基因組通過RdDM（RNA-directed DNA methylation）途徑使其DNA發生甲基化，進而維持轉座子的表觀沉默。植物基因組中轉座子的插入對于植物來說并非都有害處，轉座子會引入新的cis-element或者通過DNA的甲基化，從而產生遺傳和表觀遺傳的變異而產生新的基因表達模式，進而影響植物的生長發育和抗逆性狀，例如血橙的紅色和玉米的抗旱。因此，轉座子并非是junk DNA片段，其對于推動植物的進化起到重要作用。然而，轉座子在植物逆境響應中的作用仍知之甚少。干旱脅迫對于果樹的生長發育及果園的生態完整性影響重大，植物通過多種機制應對干旱脅迫，氧化還原途徑是植物耐旱機制的重要組成部分。RFNR（Root-type ferredoxin-NADP+oxidoreductase，根型鐵氧還蛋白-NADP+氧化還原酶）被報道參與植物體內的氧化還原平衡，然而其是否參與抗旱還未曾報道，植物RFNR是否存在自然變異而影響抗旱并不清楚。
該課題組從PEG模擬干旱處理的RNA-seq數據中發掘到RFNR1基因，其表達受PEG誘導表達。鑒于蘋果的雜合性，研究人員以GL-3（皇家嘎啦的實生后代，用于蘋果轉基因的背景材料，二倍體）為研究對象，從中克隆得到蘋果RFNR1的等位基因MdRFNR1-1和MdRFNR1-2，這兩個等位基因編碼的蛋白具有三個氨基酸的差異，但體外酶活實驗和轉基因愈傷的PEG處理實驗表明其功能并無差異（圖1），均能對NADPH起到催化作用及對干旱脅迫起正調控功能。隨后，RFNR1的功能在轉基因植物中得到驗證。
圖1.NADPH依賴的MdRFNR1等位基因編碼蛋白的酶活性
該研究發現，MdRFNR1的兩個等位基因表達水平存在差異，MdRFNR1-1的表達水平顯著高于MdRFNR1-2，PEG誘導MdRFNR1-1表達而非MdRFNR1-2。進一步研究發現MdRFNR1-1的啟動子區域存在MITE的插入，并命名為MITE-MdRF1。GUS實驗表明MITE-MdRF1在促進基因表達及干旱脅迫的誘導中起到重要作用（圖2）。進一步的實驗表明，MITE-MdRF1對于MdRFNR1-1的調控在蘋果抗旱中起正調控功能。
圖2.MITE插入MdRFNR1-1啟動子與等位基因的表達和干旱脅迫誘導相關
通過PCR基因分型發現，在檢測的371個蘋果品種和資源中，有30個蘋果種質的RFNR1啟動子中存在MITE-MdRF1插入。為了進一步確認MITE-MdRF1插入RFNR1啟動子與蘋果自然背景下的耐旱性之間的聯系，研究人員挑選了部分種質進行葉片失水處理并測定POD（過氧化物酶）和CAT（過氧化氫酶）活性以及MDA（丙二醛，反應干旱脅迫下細胞完整性）含量。結果表明，在葉片失水處理后，RFNR1啟動子區域含有MITE-MdRF1插入的種質具有更高的POD和CAT活性，以及更低的MDA累積（圖3）。
圖3.MITE插入不同種質RFNR1啟動子與葉片失水下的MDA含量、POD和CAT活性相關
研究進一步表明MITE-MdRF1處具有24-nt sRNA的積累，可能會通過RdDM途徑而引起DNA的甲基化，locus-specific BS-seq、McrBC-qPCR及5-AZA（DNA甲基化抑制劑）處理證明MITE-MdRF1發生甲基化，且甲基化程度受PEG模擬干旱誘導（圖4）。
圖4.MITE-MdRF1的DNA甲基化與MdRFNR1-1響應干旱脅迫正相關
甲基化程度升高通常會抑制基因的表達，而本研究表明甲基化程度與基因表達正相關，基于前人的報道，研究人員對其可能的機制進行了深入研究。SUVH1和SUVH3可作為DNA甲基化識別蛋白，通過招募DNAJ1和DNAJ2蛋白形成蛋白復合體，進而促進基因表達。本研究通過DAP-qPCR及雙熒光素酶試驗證明蘋果中MdSUVH1和MdSUVH3可結合于甲基化MITE-MdRF1，并通過與MdDNAJ1、MdDNAJ2和MdDNAJ5形成蛋白復合體進而激活MdRFNR1-1基因的表達（圖5）。隨后通過轉基因植物和蘋果愈傷組織證明了MdSUVH1和MdDNAJ1在促進蘋果抗旱中的功能。
圖5.MdSUVH-MdDNAJ蛋白復合體結合甲基化MITE-MdRF1并激活MdRFNR1-1以響應干旱脅迫
綜上所述，該研究揭示了干旱脅迫條件下MITE的插入對MdRFNR1-1順式調節中的作用（圖6），并且這項工作提供了一個額外的案例，其中TE插入和DNA甲基化與轉錄呈正相關。
圖6.調控模塊“MdSUVH–MdDNAJ蛋白復合體—MITE-MdRF1—MdRFNR1-1”影響蘋果抗旱性的工作模型
博士研究生牛春東、姜麗娟及曹富國為該論文共同第一作者，管清美教授為該論文通訊作者，馬鋒旺教授及李超教授在本研究中提供了指導與幫助。本研究得到國家自然科學基金（32172530）、深圳市中央引導地方科技發展專項資金（2021SZVUP117）、陜西省科技重大專項（2020zdzx03-01-02）及博士后科學基金（2021M702692）的資助。