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（ i ）能夠阻礙 DNA 聚合酶在反轉錄過程的單堿基延伸；（ ii ）能夠降低缺口連接酶的連接效率。 SELECT 方法采用熒光定量 PCR 的方法進行定量。結合方法優化，發展了 SELECT 方法的 3 個應用實例：（ i ）在生物學樣本總 RNA 或總 mRNA 中檢測 mRNA 或 lncRNA 上單位點是否含有 m6A 修飾；（ ii ）檢測生物學樣本中特定 m6A 位點的修飾比例；（ iii ）鑒定 m6A 甲基轉移酶或去甲基酶的生理作用靶點。 SELECT 方法不僅簡化了生物學樣品中 m6A 修飾的檢測過程，實現低豐度 RNA 中 m6A 單堿基分辨率的檢測，還能夠應用于其他 RNA 化學修飾的檢測中，例如 N1- 甲基腺嘌呤（ N1-methyladenosine ， m1A ）和 2’-O- 甲基化修飾（ 2’-O-methylation ， Nm) 等。

軸突導向因子受體Robo3在調控軸突導向過程中發揮著重要作用。Robo3有兩個選擇性剪接體，Robo3.1和Robo3.2；它們分別在連合神經元穿越脊髓底板前和后的軸突中特異表達，從而分別控制軸突穿越底板。姬生健在美國工作期間參與的研究表明，Robo3.2可以在穿越后的軸突中局部翻譯并受無義介導的RNA衰減（NMD）通路的調控（Colak, Ji et al., Cell）。 姬生健課題組接著對Robo3.1在連合神經元的穿越前軸突內高表達而在穿越后突觸內消失這一現象進行了深入的機制研究。課題組首次發現Robo3.1蛋白質的半衰期非常短，其蛋白水平的維持需要持續性的翻譯。接著，課題組發現Robo3.1的mRNA被m6A修飾，并可以和m6A閱讀器蛋白YTHDF1結合。小鼠的體外和體內實驗研究表明，Robo3.1的翻譯受YTHDF1調控，從而控制連合神經元的軸突導向。

鑒定了擬南芥中的 m6A 去甲基酶 ALKBH10B ，發現 ALKBH10B 缺失會導致擬南芥顯著的晚花表型， ALKBH10B 通過影響 FT ， SPL3 和 SPL9 的甲基化水平調控擬南芥的成花誘導。不同的識別蛋白通過對 m6A 的結合，對 mRNA 的加工代謝產生不同的調控作用， 進而 影響細胞不同的生理功能。通過開發甲醛交聯- 免疫共沉淀(Formaldehyde-crosslinking and immunoprecipitation, FA-CLIP) 技術，鑒定出全轉錄組水平的ECT2-mRNA 相互作用位點，揭示ECT2 主要結合mRNA 的 3' 非翻譯區(3'UTR), 并且傾向于結合保守序列 URUAY (R=G>A, Y=U>A,  其中 UGUAY 序列 占 90% 以上 ) 。使用植物細胞核裂解液進行的體外酶活實驗和凝膠遷移實驗（ EMSA ）證明 UGUA 序列為 植物特有的m6A 保守序列，且UGUm6A 可以被ECT2 高特異性識別。亞細胞定位實驗表明ECT2 蛋白分布于細胞核和細胞質，結合高通量測序數據分析，推測ECT2 具有雙重功能，ECT2 可能在細胞核中通過結合甲基化的UGUA 調控pre-mRNA 的 3'UTR 加工，在細胞質中ECT2 促進mRNA 的穩定性。進一步機理研究發現影響表皮毛發育的三個基因ITB1, TTG1 及DIS2 的轉錄本可以被m6A 修飾且被ECT2 結合，在 ECT2 的T-DNA 插入突變體中，ITB1, TTG1 及DIS2 的mRNA 穩定性降低，mRNA 表達量水平降低，繼而導致 ect2 突變體中表皮毛分叉數增多。

發現腫瘤細胞上皮間質化（EMT）過程中mRNA的m6A顯著上調，其可通過促進EMT關鍵轉錄因子Snail的翻譯從而促進腫瘤EMT及侵襲轉移。在腫瘤細胞EMT過程中，mRNA的m6A修飾增加。甲基轉移酶METTL3的缺失使得m6A水平下調，并抑制癌細胞在體外和體內的遷移、侵襲和EMT過程。m6A-seq和功能實驗表明，EMT的關鍵轉錄因子Snail的表達受m6A調控，且過表達Snail能逆轉METTL3缺失導致的細胞EMT抑制。進一步研究表明，Snail mRNA的CDS區而非3’UTR區的m6A修飾，可促進其mRNA的翻譯延伸，其可能機制是通過YTHDF1與eEF-2的共結合促進多聚核糖體對其的翻譯作用。體內實驗表明METTL3敲除細胞株轉移能力較野生型顯著下調，過表達Snail則可在一定程度上逆轉此現象。臨床分析表明肝癌組織中Mettl3和YTHDF1表達高于癌旁組織，其上調是肝癌患者總體生存率（OS）不良預后因素。

m6A修飾參與腫瘤細胞的糖酵解和ATP生成。甲基轉移酶METTL3的缺失使得m6A水平下調，并抑制腫瘤細胞的葡萄糖攝入、乳酸產生速率和ATP生成。m6A-seq和功能實驗表明，PDK4的表達受m6A調控，且過表達PDK4能逆轉METTL3缺失導致的腫瘤細胞糖酵解和ATP生成抑制。進一步研究表明，PDK4 mRNA的5’UTR區而非3’UTR區的m6A修飾，可通過與YTHDF1/eEF-2復合物和IGF2BP3結合，從而正向調節其mRNA的翻譯延伸及mRNA穩定性。此外，TATA結合蛋白（TBP）可以通過與METTL3啟動子結合增強其轉錄及在宮頸癌細胞中的表達。體內和臨床分析表明，m6A/PDK4在宮頸癌和肝癌組織表達上調，且對其發生發展具有促進作用。?本研究利用dCas13b融合去甲基化酶ALKBH5，結合靶向mRNA的gRNA，構建出可在活細胞內靶向mRNA的m6A去甲基化修飾體系dm6ACRISPR。該體系具有特異性強、去甲基化效率高和脫靶率低等特點。研究表明，dm6ACRISPR可實現CYB5A mRNA的單位點及CTNNB1 mRNA的多位點去甲基化，提高靶mRNA穩定性。同時，dm6ACRISPR具有高度錯配不耐受的特點，其細胞內脫靶率僅為0.03%。此外，在腫瘤細胞中運用dm6ACRISPR體系靶向促癌基因EGFR和MYC，可顯著降低其表達水平，同時明顯抑制腫瘤細胞生長，表明dm6ACRISPR在疾病防治上具有潛在價值。

隨著首個RNA修飾N6-甲基腺嘌呤（m6A）的去修飾酶FTO的發現，RNA表觀遺傳學/表觀轉錄組學開始興起并成為表觀遺傳學新的研究熱點。m6A作為首個被發現的可逆RNA修飾，廣泛存在于mRNA，依賴修飾酶、去修飾酶和結合蛋白發揮調控功能。已發現m6A具有調控mRNA剪接、出核、穩定性和蛋白翻譯等功能，可以參與發育、配子發生、細胞重編程、生物節律、疾病等多種生理和病理過程的功能調控。為了更好地研究m6A生物功能和臨床病理研究，開發m6A高通量測序技術一直是研究的熱點。 現有m6A測序技術主要依賴于m6A抗體富集技術，包括低分辨率的m6A-seq/MeRIP-seq和聯用iCLIP或PAR-CLIP技術的高分辨率m6A測序技術miCLIP 或PA-m6A-seq?？贵w存在對特定RNA序列或結構的潛在非特異性結合，為了解決抗體方法的種種問題，研究者們做出了各種嘗試，近期開發了兩類無需抗體的m6A測序技術，一類為利用對特定甲基化序列（m6ACA）敏感的RNA核酸內切酶MazF輔助的測序方法（m6A-REF-seq or MAZTER-seq），此類方法只能檢測16~25%的m6A位點；另一種是在細胞內表達融合m6A-binding domain（YTH）與胞嘧啶脫氨酶（APOBEC1）的融合蛋白實現的m6A測序（DART-seq），但該方法依賴于細胞轉染效率且受限于體外樣品的使用。 賈桂芳課題組一直致力于開發和利用核酸化學生物學技術研究RNA化學修飾在動植物中的生物功能研究。在本課題中，賈桂芳課題組巧妙地利用m6A的去甲基酶FTO蛋白作為催化劑，將mRNA上化學惰性的m6A轉化為高反應活性的中間態產物N6-羥甲基腺嘌呤（hm6A），然后利用二硫蘇糖醇（DTT）的巰基與hm6A發生亞胺1,2加成反應，將不穩定的hm6A轉化為更穩定的巰基加成產物dm6A。dm6A上的自由巰基可以與甲烷硫代磺酸（methanethiosulfonate，MTSEA）快速反應，實現在mRNA上m6A的位置標記生物素Biotin，最終可被鏈霉親和素珠捕獲，從而富集含有m6A修飾的RNA片段供后續高通量測序使用。

   FTO對人體發育至關重要，FTO酶活功能的紊亂會影響發育和多種疾病的發生，包括肥胖和癌癥等。N6-甲基腺嘌呤（m6A）作為mRNA上含量最為豐富的甲基化修飾，是首個被報道的FTO去甲基酶活生理底物。之后陸續報道FTO生理底物還包括mRNA上5’帽端后的N6，2'-O-二甲基化腺嘌呤（cap m6Am），snRNA的m6A和m6Am，tRNA的N1-甲基腺嘌呤（m1A），除此之外還有體外活性底物單鏈DNA上的N6-甲基脫氧腺嘌呤（6mA）和N3-甲基胸腺嘧啶（3mT）與單鏈RNA上的N3-甲基尿嘧啶（m3U）。FTO如何識別眾多的核酸修飾堿基，是否有催化選擇性，如何結合多種RNA，FTO為什么對cap m6Am的活性高于單鏈RNA上的m6A，及FTO為什么對單鏈RNA或DNA上的m1A沒有活性卻對tRNA或莖環結構上的m1A有活性？回答這些FTO的酶催化分子機制有待于蛋白-核酸復合物晶體結構的解析。然而FTO蛋白與核酸底物結合力太弱，致使獲得FTO蛋白-核酸復合物晶體結構一直是該領域的挑戰和難點。

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產品詳細介紹性能特點：1、微機控制，觸摸面板，數字顯示。2、采用交流變頻電機，進口環保壓縮機，進口高速軸承。3、自動計算RCF值。4、可直接設定RCF或轉速，可進行梯度分離。5、具有超溫、超速、不平衡、門蓋安全保護功能。6、制冷、加熱雙回路控溫。技術參數：型號名稱： DL-6M/DL-6MI 冷凍大容量離心機顯示方式： LED/LCD最高轉速： 6000rpm旋轉精度： ±30rpm最大相對離心力： 6680×g最大容量： 6×1000mL控溫范圍： －20～40℃控溫精度： ±1℃定時范圍： 0～23h59min電機： 交流變頻門鎖： 機械門鎖噪音： ≤65dB（A）電源： AC220V，50Hz，30A外形尺寸： 840×730×1240mm重量： 260kg轉子：NO.1角轉子： 6000rpm，6680×g，6×500mLNO.2水平轉子： 4200rpm，5100×g，6×1000mL關鍵詞：冷凍大容量離心機

發現在軸突中特異性抑制FTO或敲低FTO均顯著地降低了GAP-43 mRNA 的局部翻譯。進一步的抗m 6 A免疫沉淀實驗證實FTO通過調節GAP-43 mRNA的m 6 A水平從而影響GAP-43的局部翻譯。在過表達野生型GAP-43的神經元中，抑制FTO可以顯著地降低GAP-43的局部翻譯水平，同時顯著地抑制了軸突的生長。而在過表達m 6 A 位點突變的GAP-43的神經元中，抑制FTO對GAP-43的蛋白水平及軸突的生長均沒有影響。因此，該研究證實FTO可以通過調控軸突中GAP-43 mRNA的m 6 A水平從而影響其局部翻譯，進而調節軸突的生長。