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開發了一個高效的捕獲RNA結合蛋白雙鏈RNA底物的建庫測序技術（irCLASH）以及后續的一整套生物信息學分析方法；首次在轉錄組水平上系統地繪制了人類ADAR蛋白的內源雙鏈RNA底物圖譜；揭示了決定ADAR結合效率和編輯效率的底物特征和ADAR結合長雙鏈RNA的體內模型。       該研究利用irCLASH技術系統構建和分析了人類ADAR1、ADAR2及ADAR3的雙鏈RNA底物圖譜，發現與之前根據計算推導的研究設想不同，ADAR具有大量的、長距離的雙鏈RNA底物。該研究發現不完全互補配對的底物與ADAR蛋白也有很好的親和度，特別是ADAR2家族成員。研究還進一步揭示了決定ADAR結合效率和編輯效率的底物特征。irCLASH測序技術及后續的整套生物信息學分析方法的開發為研究雙鏈RNA結合蛋白的內源底物提供了新的工具。同時，該研究揭示的ADAR與底物相互作用及催化特性為研究人員開發高效的RNA編輯工具提供了資源寶庫及改進方向。

肝癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是全球第五大常見的消化道惡性腫瘤，也是全球第三大致死性癌癥。我國肝癌病發率位居全球首位，肝癌已成為嚴重威脅我國人民健康和生命的疾病。由于肝癌的早期診斷缺乏可靠的生物標志物，肝癌患者通常在肝癌晚期才被診斷，其5年生存率僅為15%。目前肝癌診斷主要依賴于影像學檢查或者血液活檢中的甲胎蛋白（AFP）標志物等手段。但這些傳統方法對于癌變早期存在敏感性低、特異性低等局限性，例如，血液活檢中的甲胎蛋白特異性差，且往往到癌癥晚期才能檢測到其含量升高，可能延誤最佳的治療時機。因此亟需找到一種可用于肝癌診斷及預后的可靠的新型液體活檢標志物。 液體活檢為一門新型的檢測技術，越來越受到關注。目前可以作為無創檢測的生物標志物大多數是蛋白質分子和DNA分子，但這些標志物在靈敏度、誤診率和經濟成本高等方面的缺陷導致它們很難被普及。RNA分子在細胞中擁有多個拷貝并且存在多種轉錄調控形態，可以更加準確地反映細胞狀態和癌癥動態發展過程，而且其檢測成本也很低。 過去體液中的RNA標志物研究主要集中在miRNA等小RNA的研究，相對于細胞中大量的長RNA，miRNA的數量要少一個到兩個數量級，因此提供的信息也有限。本項目另辟蹊徑，通過對大量肝癌患者（HCC）、慢性乙型肝炎患者(CHB)和健康個體(HD)進行血漿中非編碼RNA表達譜的高通量測序檢測和分析，發現了一種非編碼RNA，srpRNA (RN7SL1)，的功能結構域可以穩定存在于血液中，并在區分肝癌患者和陰性對照組時具有良好的敏感度和特異性（約90%）。并且，通過在獨立驗證集上的實時熒光定量檢驗（RT-qPCR），該srpRNA (RN7SL1)的功能結構域被證明在 肝癌的診斷及預后方面都具有可靠的臨床表現。

項目成果/簡介:肝癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是全球第五大常見的消化道惡性腫瘤，也是全球第三大致死性癌癥。我國肝癌病發率位居全球首位，肝癌已成為嚴重威脅我國人民健康和生命的疾病。由于肝癌的早期診斷缺乏可靠的生物標志物，肝癌患者通常在肝癌晚期才被診斷，其5年生存率僅為15%。目前肝癌診斷主要依賴于影像學檢查或者血液活檢中的甲胎蛋白（AFP）標志物等手段。但這些傳統方法對

利用A-to-I RNA編輯作為miRNA反義鏈表達的有利證據。通過靶向RNA測序技術，宋玉龍和李麗詩等利用A-to-I RNA編輯推導鏈表達的方向，揭示了miRNA基因座反義RNA的廣泛表達和編輯現象。宋玉龍和李麗詩等發現miRNA和其反義RNA形成了一個相互調控的網絡：miRNA可以下調其反義RNA的表達水平；反義RNA在轉錄水平和轉錄后水平調控miRNA的表達和加工。此外，A-to-I RNA編輯可以穩定反義RNA的結構，避免其被配對的miRNA所降解。這一研究揭示了前人所未知的miRNA反義鏈編輯現象的廣泛性，為RNA編輯的研究開辟了新的研究方向。

   FTO對人體發育至關重要，FTO酶活功能的紊亂會影響發育和多種疾病的發生，包括肥胖和癌癥等。N6-甲基腺嘌呤（m6A）作為mRNA上含量最為豐富的甲基化修飾，是首個被報道的FTO去甲基酶活生理底物。之后陸續報道FTO生理底物還包括mRNA上5’帽端后的N6，2'-O-二甲基化腺嘌呤（cap m6Am），snRNA的m6A和m6Am，tRNA的N1-甲基腺嘌呤（m1A），除此之外還有體外活性底物單鏈DNA上的N6-甲基脫氧腺嘌呤（6mA）和N3-甲基胸腺嘧啶（3mT）與單鏈RNA上的N3-甲基尿嘧啶（m3U）。FTO如何識別眾多的核酸修飾堿基，是否有催化選擇性，如何結合多種RNA，FTO為什么對cap m6Am的活性高于單鏈RNA上的m6A，及FTO為什么對單鏈RNA或DNA上的m1A沒有活性卻對tRNA或莖環結構上的m1A有活性？回答這些FTO的酶催化分子機制有待于蛋白-核酸復合物晶體結構的解析。然而FTO蛋白與核酸底物結合力太弱，致使獲得FTO蛋白-核酸復合物晶體結構一直是該領域的挑戰和難點。

鑒定了擬南芥中的 m6A 去甲基酶 ALKBH10B ，發現 ALKBH10B 缺失會導致擬南芥顯著的晚花表型， ALKBH10B 通過影響 FT ， SPL3 和 SPL9 的甲基化水平調控擬南芥的成花誘導。不同的識別蛋白通過對 m6A 的結合，對 mRNA 的加工代謝產生不同的調控作用， 進而 影響細胞不同的生理功能。通過開發甲醛交聯- 免疫共沉淀(Formaldehyde-crosslinking and immunoprecipitation, FA-CLIP) 技術，鑒定出全轉錄組水平的ECT2-mRNA 相互作用位點，揭示ECT2 主要結合mRNA 的 3' 非翻譯區(3'UTR), 并且傾向于結合保守序列 URUAY (R=G>A, Y=U>A,  其中 UGUAY 序列 占 90% 以上 ) 。使用植物細胞核裂解液進行的體外酶活實驗和凝膠遷移實驗（ EMSA ）證明 UGUA 序列為 植物特有的m6A 保守序列，且UGUm6A 可以被ECT2 高特異性識別。亞細胞定位實驗表明ECT2 蛋白分布于細胞核和細胞質，結合高通量測序數據分析，推測ECT2 具有雙重功能，ECT2 可能在細胞核中通過結合甲基化的UGUA 調控pre-mRNA 的 3'UTR 加工，在細胞質中ECT2 促進mRNA 的穩定性。進一步機理研究發現影響表皮毛發育的三個基因ITB1, TTG1 及DIS2 的轉錄本可以被m6A 修飾且被ECT2 結合，在 ECT2 的T-DNA 插入突變體中，ITB1, TTG1 及DIS2 的mRNA 穩定性降低，mRNA 表達量水平降低，繼而導致 ect2 突變體中表皮毛分叉數增多。

內含子是基因中不具有編碼作用的片段，它會被轉錄到前體RNA中，但在mRNA加工過程中被剪切掉，而內含子剪切是真核生物mRNA成熟的關鍵步驟。在酵母中，當RNA聚合酶II(Pol-II)轉錄到內含子下游45nt時已經有一半的內含子完成了剪切。但高等真核生物，尤其植物中RNA共轉錄剪切速率，剪切狀態和其他RNA加工過程之間的關系又是什么樣的呢？為解答這一疑惑，翟繼先課題組開展了系列研究分析。

研究開發了 “ 熒光團輔助的 RNA 鄰近標記和測序技術 ” ，簡稱 “CAP-seq” 。   該方法通過可見光激發遺傳靶向的光敏蛋白 miniSOG 產生活性氧， 介 導鄰近 RNA 分子上的鳥嘌呤與具有生物正交功能把手的氨基探針進行共價交聯，既而通過富集純化與高通量測序檢測，實現 miniSOG 定位的亞細胞區域內 轉錄 組的空間特異性標記與鑒定。 利用 CAP-seq ，他們系統研究了幾個亞細胞區域的轉錄組，包括線粒體基質轉錄組 、 內質網表面 轉錄組 以及 線粒體外膜附近轉錄組。這些研究結果表明 CAP-seq 對 活細胞中開放區域的 RNA 標記具有良好的空間特異性和覆蓋度 。 他們在線粒體外膜附近檢測到 30 個編碼氧化磷酸化途徑相關蛋白的 RNA 和多達 55 個編碼核糖體蛋白的 mRNA ，這一結果不僅支持了線粒體蛋白在線粒體外膜被翻譯后直接轉運進線粒體的模型，還暗示著線粒體功能可能與蛋白質的翻譯調節有關。 CAP-seq 具有操作簡單、空間選擇性高、生物相容性好的特點，將成為一項適合于在多種生物系統中研究亞細胞 轉錄組 的新技術。

真核生物中，mRNA的降解對于mRNA的數量和質量調控都發揮關鍵的作用。成熟的mRNA在細胞中作為模板指導蛋白質的合成，而參與蛋白質翻譯的mRNA的數量受到精確調控。這一過程不僅取決于基因的轉錄水平，也決定于mRNA的降解速率。mRNA 降解主要包括多聚腺苷酸尾（polyA tail）的去除，脫帽（decapping）和核酸酶（ribonuclease）的消化。新近的研究表明，植物細胞中mRNA也可以在蛋白翻譯進行的同時被核酸酶消化，即mRNA逐步退出蛋白翻譯過程與其降解是偶聯的過程。為保證蛋白翻譯的準確性，植物細胞主要通過依賴翻譯的mRNA質量監控機制進行缺陷mRNA的分選及清除，從而實現mRNA質量的調控。這些mRNA質量監控機制同時也可以作為一種基因表達調控方式精細調節植物生長發育及環境適應性。在有缺陷的mRNA不能被核酸酶及時清除時，植物啟動依賴小RNA的轉錄后基因沉默途徑（PTGS, posttranscriptional gene silencing）加以剪切使其喪失功能。轉錄后基因沉默作為一種防御手段清除過量產生的異常mRNA尤其是外源基因表達的mRNA，同時mRNA降解途徑確保轉錄后基因沉默極少作用于內源編碼基因。該綜述對上述過程的分子機制及其在植物中的生物學功能進行梳理論述，并展望植物領域關于mRNA動態降解以及mRNA的數量和質量監控機制有待研究的問題。

哺乳動物基因組的廣泛轉錄產生了大量的非編碼RNA，相比于細胞質定位的蛋白編碼mRNA，這些非編碼RNA如長鏈非編碼RNA（lncRNA）、啟動子和增強子關聯的不穩定轉錄本（uaRNA、eRNA）等更傾向于結合染色質參與調控染色質結構、轉錄和RNA加工等過程。盡管零星報導少數RNA核滯留的現象，但為何大部分lncRNA會滯留于染色質上行使調控功能，仍是個不解之謎。上世紀80年代初，Joan Steitz通過系統性紅斑狼瘡患者血液抗體分離提取 U1,U2, U4, U5和U6小核糖核蛋白粒子（又稱為 snRNP），揭示了它們參與RNA剪接的經典功能。近年來施一公團隊系統報導了真核生物剪切體的原子結構和生化功能。然而，一直讓人困惑的是，細胞內U1 snRNP的數量為什么比其它剪接相關snRNP高 2-5倍。雖然Gideon Dreyfuss和Phil Sharp等團隊曾揭示U1 snRNP調控轉錄終止和方向的非經典功能，U1 snRNP在細胞中的豐富存在仍然是一個讓人困惑的問題。為了探究lncRNA的染色質結合機制，研究者首先建立和運用一套新穎的mutREL-seq方法來高精度篩選調控RNA定位的關鍵序列，意外發現了U1 snRNP識別位點參與調控候選RNA的染色質滯留。相比于蛋白編碼基因，lncRNA轉錄本含有更多的U1識別位點（同時也是潛在的5’剪接供體位點），而其基因組區域具有更少的3’剪接受體位點。并且U1 snRNP更高水平地結合在lncRNA上。隨后，研究者分別使用antisense morpholino oligos（AMO）和auxin-induced degron（AID）誘導蛋白降解系統，來抑制U1 snRNA和核心蛋白組分SNRNP70的功能。研究者發現小鼠胚胎干細胞中近一半的lncRNA受U1 snRNP調控。另外，與轉錄調控元件關聯的不穩定非編碼轉錄本如uaRNA、eRNA等，它們的染色質結合在U1 snRNP抑制后也顯著下降。研究者進一步證明了U1 snRNP直接調控成熟lncRNA與染色質的結合，而不是通過影響RNA合成、加工或降解過程的動態變化所產生的間接影響。機制上，研究者鑒定了U1 snRNP在染色質上的互作蛋白，發現U1 snRNP結合特定磷酸化狀態的RNA轉錄聚合酶II（Pol II）。轉錄抑制明顯降低了U1 snRNP及其所調控的非編碼RNA與染色質的結合，表明U1 snRNP通過與磷酸化的Pol II互作來介導其互作RNA與染色質的結合。最后，研究者通過以lncRNA Malat1為例，進一步驗證了U1 snRNP對其染色質結合的調控作用。去除SNRNP70后，絕大部分Malat1 “核斑”定位信號消失，并彌散在核質及細胞質中。同時，Malat1在活躍表達基因染色質區域的結合信號顯著下降，表明U1 snRNP不僅可以將Malat1滯留在染色質上，同時也參與調控后者在染色質上的移動及其與靶基因的結合。綜上，研究者提出如下模型（圖1）：5’和3’剪接位點在lncRNA上的不對稱分布，致使U1 snRNP持續結合在lncRNA轉錄本上，而不能通過RNA剪接過程釋放，從而介導了lncRNA的染色質滯留。磷酸化Pol II進一步介導了lncRNA-U1 snRNP復合體在染色質上的移動（mobilization）。對于大多數低豐度、不穩定的lncRNA，它們只能靶向結合鄰近的染色質區域（順式cis作用）；而對于少數穩定和高豐度的lncRNA，如Malat1，U1 snRNP促進了其遷移和結合更多的靶基因區域（反式trans作用）。圖1. U1 snRNP介導非編碼RNA染色質結合的模式圖。論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41586-020-2105-3