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本發(fā)明公開了一種靶向降解p300/CBP蛋白的化合物及其合成方法和應(yīng)用，涉及藥物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明首次提供了一種利用SuFEx反應(yīng)構(gòu)建蛋白水解靶向嵌合體以及其它雙功能分子的方法；本發(fā)明采用化合物CPI644的氟代磺酸酯和磺酰氟類似物作為p300/CBP蛋白配體，并通過SuFEx反應(yīng)與預(yù)先引入以不同長(zhǎng)度的烷烴作為連接臂的E3泛素連接酶配體5?OH和4?OH沙利度胺進(jìn)行連接，制備了兩個(gè)系列12個(gè)PROTACs分子；本發(fā)明設(shè)計(jì)的PROTACs分子具有降解p300/CBP蛋白的能力，并且PROTACs分子可以在人乳腺癌細(xì)胞中濃度依賴性地降解p300/CBP蛋白；這些PROTACs分子表現(xiàn)出了較好的抗腫瘤效果，在腫瘤的診斷及治療方面有廣闊的應(yīng)用前景。

b0,+AT-rBAT是人體內(nèi)的一種氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合物，屬于異源多聚體氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（HAT）家族。異源多聚體氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，由輕鏈蛋白和重鏈蛋白構(gòu)成。b0,+AT是其中的輕鏈蛋白，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)底物。而rBAT是其中的重鏈蛋白，具有負(fù)責(zé)輕鏈蛋白細(xì)胞膜定位（即將輕鏈蛋白“護(hù)送”到細(xì)胞膜上）和維持輕鏈蛋白的穩(wěn)定性的作用。 b0,+AT主要分布于小腸和腎臟中。b0,+AT或者rBAT的突變，會(huì)誘發(fā)胱氨酸尿癥，一種先天性遺傳疾病。患者尿路中常有胱氨酸結(jié)石形成，造成腎絞痛，可引起尿路感染和腎功能衰竭。該病作為一種隱性遺傳疾病在人群中的發(fā)病率約為1/7000，屬于罕見病的一種。研究b0,+AT-rBAT的最新研究成果，揭開了胱氨酸尿癥發(fā)病的分子機(jī)理。復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和功能，將能幫助我們認(rèn)識(shí)胱氨酸尿癥，為可能的治療方案提供線索。 本項(xiàng)研究工作在全世界首次解析了b0,+AT-rBAT的高分辨率電鏡結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)顯示，b0,+AT蛋白與rBAT蛋白首先形成異源二聚體分子，然后兩個(gè)異源二聚體分子通過rBAT蛋白的相互作用再進(jìn)一步形成一個(gè)二聚體。體外轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)表明rBAT蛋白對(duì)b0,+AT蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)活性是必需的；也就是說，b0,+AT要正常發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)功能，需要有rBAT蛋白的存在。這與周強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室2019年解析的LAT1-4F2hc復(fù)合物相似。LAT1-4F2hc復(fù)合物同屬HAT家族，其中的4F2hc蛋白是LAT1蛋白發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)活性所必需的。 同時(shí)，該研究也首次解析了b0,+AT-rBAT和它的天然底物精氨酸的復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，解釋了它的底物識(shí)別機(jī)制。如果把b0,+AT-rBAT復(fù)合物比做生物膜上的一艘船，那么被轉(zhuǎn)運(yùn)的精氨酸，可以被理解為“貨物”。研究人員通過解析b0,+AT-rBAT與底物的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，可以了解該“貨物”如何加載到船上的——這個(gè)過程，即為“識(shí)別機(jī)制”。 在底物結(jié)合點(diǎn)附近，科研團(tuán)隊(duì)還鑒定出了底物結(jié)合位點(diǎn)附近的一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控區(qū)域。通過點(diǎn)突變和同位素轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，他們證明了該轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控區(qū)域?qū)τ赽0,+AT-rBAT的轉(zhuǎn)運(yùn)功能至關(guān)重要。西湖大學(xué)黃晶實(shí)驗(yàn)室采用了分子模擬的方式，亦驗(yàn)證了該區(qū)域的重要性。 對(duì)于b0,+AT-rBAT復(fù)合物突變而導(dǎo)致的胱氨酸尿癥，基于上述研究，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步揭開了該疾病發(fā)生的機(jī)理。通過分析已解析出的b0,+AT-rBAT的高分辨率結(jié)構(gòu)，研究人員對(duì)突變的位點(diǎn)進(jìn)行了準(zhǔn)確定位，并對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行了體外生化實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。結(jié)果顯示，b0,+AT-rBAT的關(guān)鍵位點(diǎn)的突變影響了氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)的活性，造成了胱氨酸尿癥。

本發(fā)明公開了一種具有抗氧化和抗炎功效的重組海洋蛋白及其制備方法與應(yīng)用。該發(fā)明通過合成生物學(xué)技術(shù)，成功構(gòu)建了由多重海洋生物蛋白組成的重組海洋蛋白，其包含眾多活性功能氨基酸，具有顯著的抗氧化和抗炎功效。所述重組海洋蛋白的制備方法為，使用同源重組法將所述重組海洋蛋白的編碼基因與載體連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體，導(dǎo)入枯草芽孢桿菌中，構(gòu)建重組枯草芽孢桿菌，將其接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，即得。本發(fā)明的重組海洋蛋白具有顯著優(yōu)異的抗炎和抗氧化效果，還為抗氧化和抗炎領(lǐng)域提供了新的解決方案，具有廣闊的應(yīng)用前景。

項(xiàng)目成果/簡(jiǎn)介:本發(fā)明提供茶樹咖啡堿合成酶基因啟動(dòng)子TCSP及其在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用.本發(fā)明以茶樹DNA為模板,用GenomeWalking方法克隆得到茶樹TCS基因啟動(dòng)子序列,然后利用Gateway技術(shù)構(gòu)建重組植物表達(dá)載體pKGWFS7TCSP,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化,以表達(dá)GUS基因的方式進(jìn)行啟動(dòng)子活性功能驗(yàn)證.本發(fā)明首次從茶樹中克隆出特異性咖啡堿合成酶基因啟動(dòng)子TCSP,并驗(yàn)證了其活性,對(duì)于揭示茶樹咖啡堿合成的機(jī)理,生物調(diào)控茶樹咖啡堿的含量具有重要意義.

中國(guó)科大陳宇星教授、周叢照教授和孫林峰教授課題組合作闡明了金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）胞壁酸（WTA）翻轉(zhuǎn)酶TarGH轉(zhuǎn)運(yùn)WTA的機(jī)制和TarGH特異性抑制劑Targocil的抑制機(jī)制。該研究成果在線發(fā)表在微生物領(lǐng)域?qū)I(yè)雜志mBio上。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是主要的臨床致病菌之一，其引發(fā)的感染難以治愈甚至可能致死。由于近年來抗生素濫用，出現(xiàn)了對(duì)所有的β-內(nèi)酰胺類藥物都具有抗性的MRSA菌株。研究表明S. aureus細(xì)胞壁主要成分WTA是引起耐藥性的關(guān)鍵因素之一。在革蘭氏陽性菌中，WTA是一類共價(jià)連接在肽聚糖上的陰離子多聚物。WTA在細(xì)菌分裂、生物膜形成、宿主定殖以及細(xì)菌感染等過程中起著重要作用。因此，WTA合成路徑中的關(guān)鍵酶是新型抗菌藥物的重要靶點(diǎn)。在S. aureus中，WTA合成前體是N-乙酰葡糖胺修飾的多聚核糖醇長(zhǎng)鏈，其通過共價(jià)鍵連接在錨定在細(xì)胞膜上的脂質(zhì)載體Und-PP上。該Und-PP連接的多聚核糖醇長(zhǎng)鏈前體先在細(xì)胞內(nèi)完成合成，最后通過ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TarGH翻轉(zhuǎn)出細(xì)胞膜。作為最具潛力的抗生素靶標(biāo)之一，TarGH及其抑制劑得到廣泛研究。先導(dǎo)化合物小分子Targocil是近期被鑒定出來特異性抑制TarGH效率較高的抑制劑，但是其抑制的分子機(jī)制并不清楚。為闡明TarGH轉(zhuǎn)運(yùn)WTA的機(jī)理以及Targocil的抑制機(jī)制，作者用冷凍電鏡方法，解析了金黃色葡萄球菌WTA翻轉(zhuǎn)酶TarGH的同源蛋白，來自Alicyclobacillus herbarius菌的TarGH結(jié)構(gòu)。其同源性為50%。TarGH結(jié)構(gòu)總體分辨率為3.9 ?，其核心結(jié)構(gòu)區(qū)域分辨率達(dá)到3.6?。由于未結(jié)合ATP，TarGH結(jié)構(gòu)處于開口朝向細(xì)胞內(nèi)的構(gòu)象狀態(tài)?；诮Y(jié)構(gòu)，作者計(jì)算出了底物轉(zhuǎn)運(yùn)通道，通過對(duì)組成通道的氨基酸殘基性質(zhì)分析并結(jié)合生理實(shí)驗(yàn)，闡明了底物特異性識(shí)別機(jī)制。通過結(jié)構(gòu)比對(duì)作者提出TarGH及其同源蛋白利用“曲柄連桿”原理來實(shí)現(xiàn)底物轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制。具有類似結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白都可以利用這一機(jī)制通過相對(duì)微小的總體構(gòu)象變化轉(zhuǎn)運(yùn)較大的底物。作者進(jìn)一步通過生化實(shí)驗(yàn)和計(jì)算機(jī)模擬確定了Targocil結(jié)合TarGH的精確位點(diǎn)，并闡明了其抑制TarGH轉(zhuǎn)運(yùn)胞壁酸的分子機(jī)制。

"磷脂酶 D （PLD）是一類具有水解作用和磷酰基轉(zhuǎn)移作用的酶, 在磷脂改性方面發(fā)揮著重要作用。它可以將大量磷脂酰膽堿(PC) 催化合成為自然界稀有的磷脂質(zhì)，如磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)和磷脂酰甘油(PG)等，合成的磷脂質(zhì)在醫(yī)藥和食品工業(yè)具有很大的應(yīng)用前景。但由于來源不足和價(jià)格高，PLD的工業(yè)應(yīng)用一直受到限制。本項(xiàng)目通過基因工程和微生物發(fā)酵技術(shù)，解決了PLD工業(yè)化應(yīng)用中難表達(dá)和表達(dá)量不足的難題，利用重組大腸桿菌發(fā)酵實(shí)現(xiàn)了PLD的高水平表達(dá)，其酶活為106 U?L-1，產(chǎn)量為748 mg?L-1，分別比目前報(bào)道的最高水平提高了100倍和20倍；同時(shí)，本項(xiàng)目還建立了一種簡(jiǎn)單有效提取重組PLD的方法，可望大大降低PLD的生產(chǎn)成本。本技術(shù)先進(jìn)，應(yīng)用前景看好，如按106 U?L-1的發(fā)酵水平生產(chǎn)，成本約100元人民幣/1000 U，目前市場(chǎng)售價(jià)在3000-6000元/1000 U，利潤(rùn)空間很大。 "

其他成果/n本發(fā)明屬于飼料添加劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種α-半乳糖苷酶軟膠囊飼料添加劑及其制備方法。該方法包括以下步驟：1)向磷酸鹽緩沖溶液中加入α-Gal，然后加入β-CD，再經(jīng)過均質(zhì)后靜置反應(yīng)，至反應(yīng)終點(diǎn)，得到α-Gal—β-CD添加液；2)將B型明膠加入水中，充分溶脹后加入甘油、防腐劑和二氧化鈦，混合均勻進(jìn)行膠化，得到膠料；3)灌裝。通過本發(fā)明得到的軟膠囊添加劑利用環(huán)糊精抑制劑對(duì)α-Gal的抑制作用，使動(dòng)物飼料中的α-Gal酶活，經(jīng)歷一個(gè)先低后高的過程，從而使飼料中的α-Gal在更合適的消化時(shí)期發(fā)揮催化作用。

本技術(shù)采用花生殼、小麥麩皮、大豆皮等農(nóng)副產(chǎn)物為原料制備 納米纖維素。首次采用生物酶結(jié)合超聲波技術(shù)以農(nóng)副產(chǎn)品為原材料制備納米級(jí) 膳食纖維，克服了目前酸法制備納米級(jí)膳食纖維污染重、周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)，建立 了一種高效、綠色、環(huán)保制備納米級(jí)膳食纖維的新方法；首次開發(fā)出納米級(jí)膳 食纖維及高纖維食品：包括面制品、淀粉制品、肉制品及功能性飲料制品等， 拓展了納米級(jí)膳食纖維的應(yīng)用范圍。本項(xiàng)目所開發(fā)的納米級(jí)膳食纖維功能性食 品，兼具優(yōu)良口感與保健功效，具有良好的市場(chǎng)前景，對(duì)建設(shè)資源節(jié)約型和環(huán) 境友好型社會(huì)具有重要的促進(jìn)作用。 生產(chǎn)條件及經(jīng)濟(jì)效益預(yù)測(cè)：納米膳食纖維素的初步市場(chǎng)估價(jià)為 15 萬元/噸。 項(xiàng)目投產(chǎn)后，年加工量 2000 噸的農(nóng)副產(chǎn)物生產(chǎn)線，估算投資額為 8000 萬，可 產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)效益 2.55 億元，實(shí)現(xiàn)利稅 1.2 萬元。年加工量 1000 噸的農(nóng)副產(chǎn)物生 產(chǎn)線，估算投資額為 4000 萬，可產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)效益 1.275 億元，實(shí)現(xiàn)利稅 8400 萬 元；年加工量 500 噸的農(nóng)副產(chǎn)物生產(chǎn)線，估算投資額為 2000 萬，可產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)效 益 6375 萬元，實(shí)現(xiàn)利稅 3200 萬元。

我國(guó)是世界上第一造紙大國(guó)，紙和紙板產(chǎn)量已超過全球總產(chǎn)量的25%。但我國(guó)木材資源匱乏，充分利用速生闊葉材資源、采用高效清潔制漿造紙技術(shù)是從根本上解決我國(guó)造紙工業(yè)面臨的資源與環(huán)境問題的有效途徑。陳嘉川教授領(lǐng)銜的科研團(tuán)隊(duì)在973計(jì)劃和國(guó)家科技支撐計(jì)劃等資助下，歷經(jīng)10余年，自主研究開發(fā)了酶促磨漿技術(shù)、酶促消潛技術(shù)、酶助漂白技術(shù)、酶精制紙漿技術(shù)等一系列制漿造紙酶催化綠色新技術(shù)，在降低磨漿能耗、消除有毒物污染、提升紙漿品質(zhì)、改善抄造性能和研發(fā)高檔紙基新材料等方面取得了突破，實(shí)現(xiàn)了國(guó)產(chǎn)木材資源的高效高值化利用。 先后在世界造紙十強(qiáng)企業(yè)山東晨鳴紙業(yè)集團(tuán)和國(guó)內(nèi)龍頭企業(yè)山東太陽紙業(yè)股份有限公司等20余家骨干企業(yè)推廣應(yīng)用，用生物酶催化技術(shù)生產(chǎn)出了優(yōu)質(zhì)木漿，并用于高級(jí)紙基材料的生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)了速生闊葉材的高效高值化利用，并產(chǎn)生了重大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。過2012-2014三年時(shí)間累計(jì)實(shí)現(xiàn)新增銷售額130.1億元，利潤(rùn)25.6億元。

本發(fā)明提供茶樹咖啡堿合成酶基因啟動(dòng)子TCSP及其在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用.本發(fā)明以茶樹DNA為模板,用GenomeWalking方法克隆得到茶樹TCS基因啟動(dòng)子序列,然后利用Gateway技術(shù)構(gòu)建重組植物表達(dá)載體pKGWFS7TCSP,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化,以表達(dá)GUS基因的方式進(jìn)行啟動(dòng)子活性功能驗(yàn)證.本發(fā)明首次從茶樹中克隆出特異性咖啡堿合成酶基因啟動(dòng)子TCSP,并驗(yàn)證了其活性,對(duì)于揭示茶樹咖啡堿合成的機(jī)理,生物調(diào)控茶樹咖啡堿的含量具有重要意義.