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本發(fā)明涉及預(yù)測重型肝炎病情基因的甲基化狀態(tài)檢測的方法及試劑，提取病人外周血單個(gè)核細(xì)胞 DNA 進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾后，分別用谷胱甘 肽 S-轉(zhuǎn)移酶 M3 甲基化（M）特異性和非甲基化（U）特異性引物對進(jìn)行甲基化 特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物判斷其甲基化狀態(tài)，有助于臨床醫(yī)生判 定重型肝炎患者的病情和指導(dǎo)治療。

研發(fā)階段/n口蹄疫（FMD）是引起的人及偶蹄動(dòng)物共患的一種烈急性、高度接觸性、發(fā)熱性傳染病。FMD在世界上許多國家流行，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失和政治影響。口蹄疫病毒（FMDV）屬于小RNA病毒科（Picornaviridae），口蹄疫病毒屬（Aphthovirus），該病毒為單股正鏈小RNA病毒，基因組長約8500個(gè)核苷酸，主要由結(jié)構(gòu)基因（P1區(qū)）和非結(jié)構(gòu)基因（P2、P3區(qū)）等構(gòu)成。該發(fā)明具體涉及一種新的含有口蹄疫病毒主要免疫原性基因的重組偽狂犬病弱毒疫苗株，該毒株屬于豬偽狂犬病毒：Pseudorabi

研發(fā)階段/n這是免疫性狀相關(guān)基因?qū)＠ㄟ^本專利的應(yīng)用，在豬育種中可以提高豬的免疫力和抗病力，節(jié)約醫(yī)藥成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。

本發(fā)明公開了一種端粒酶啟動(dòng)基因表達(dá)方法(Telomerase?Activating gene Expression，Tage)及其應(yīng)用，該表達(dá)方法基于端粒酶可結(jié)合并延長DNA分子末端的端粒酶識別序列，合成新的端粒重復(fù)序列的特性，將端粒酶特有的生物學(xué)功能與人工轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控細(xì)胞基因表達(dá)技術(shù)相結(jié)合，發(fā)展了Tage新方法。Tage技術(shù)在細(xì)胞中可以有效發(fā)生，人工轉(zhuǎn)錄因子可激活效應(yīng)基因在端粒酶陽性細(xì)胞中的表達(dá)，效應(yīng)基因的表達(dá)產(chǎn)物可有效殺滅腫瘤細(xì)胞，本發(fā)明證明Tage技術(shù)可用于殺滅腫瘤細(xì)胞，而對無端粒酶活性的細(xì)胞

一直以來，自從第二代高通量測序技術(shù)開發(fā)至今，基因組測序成本已經(jīng)降低到3000美元，我們馬上就要來到1000 dollar genome 的時(shí)代。然而從復(fù)雜冗余的基因序列中解讀出與疾病相關(guān)，與藥物相關(guān)的重要信息，已經(jīng)成為當(dāng)前生物信息學(xué)已經(jīng)成為生物信息學(xué)中最重要的挑戰(zhàn)。面對該挑戰(zhàn)，程容海等人開發(fā)了一個(gè)在線的個(gè)人基因組解碼平臺(tái)（Virtual Pharmacist）。它可以支持分析目前主流的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)格式，并且通過該軟件后臺(tái)的數(shù)據(jù)庫和算法，挖掘出個(gè)人基因組中的基因突變（Single Nucleotide Polymorphism）與藥物反應(yīng)的關(guān)聯(lián)性分析。該平臺(tái)只需要用戶上傳SNP數(shù)據(jù)文件，或者是高通量測序文件便可以自動(dòng)完成包括生物信息學(xué)分析，基因組信息解讀（genomic interpretation），并最終呈現(xiàn)給用戶一份詳細(xì)的，用戶友好的，關(guān)于195種藥物反應(yīng)的基因檢測報(bào)告。

01.成果簡介 CRISPR/Cas9是細(xì)菌在長期演化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)。其工作原理是crRNA通過堿基配對與tracrRNA結(jié)合形成tracrRNA/crRNA復(fù)合物，此復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶cas9蛋白在與crRNA配對的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈DNA。經(jīng)過研究，通過人工設(shè)計(jì)tracrRNA/crRNA，改造形成具有引導(dǎo)作用的sgRNA，可以引導(dǎo)Cas9蛋白在多種細(xì)胞的特定基因組位點(diǎn)上進(jìn)行切割、修飾，并最終實(shí)現(xiàn)基因突變、插入或缺失。因此，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基因編輯技術(shù)領(lǐng)域。 近年來，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在真核生物和原核生物中得到了廣泛的應(yīng)用。在大腸桿菌等革蘭氏陰性菌中，用一個(gè)載體表達(dá)cas9基因，同時(shí)由于革蘭氏陰性菌重組效率低，需要在這個(gè)載體上表達(dá)λ-RED重組酶；在另一個(gè)載體中表達(dá)sgRNA和用于同源重組的同源臂序列。兩個(gè)載體都轉(zhuǎn)入大腸桿菌中時(shí)，sgRNA介導(dǎo)Cas9蛋白切割基因組上特定序列，形成雙鏈斷裂，刺激同源重組的發(fā)生，從而實(shí)現(xiàn)基因編輯。 本項(xiàng)成果構(gòu)建了適用于鹽單胞菌的基于CRISPR/Cas9的基因編輯系統(tǒng)。該系統(tǒng)由兩個(gè)載體組成：第一個(gè)載體表達(dá)Cas9基因，且不需要表達(dá)λ-RED重組酶，實(shí)際操作中不再需要誘導(dǎo)λ-RED重組酶的表達(dá)，簡化了步驟流程；第二個(gè)載體表達(dá)sgRNA，并含有用于同源重組的同源臂序列。從而實(shí)現(xiàn)了基因編輯。本項(xiàng)成果的技術(shù)優(yōu)勢包括： （1）基因編輯時(shí)間由原有的20余天縮短到7-8天； （2）N個(gè)基因編輯時(shí)間由原有的N個(gè)月縮短到3+5N天； （3）無需表達(dá)λ-RED重組酶。                        圖1 鹽單胞菌TD01進(jìn)行基因編輯的流程示意圖02.應(yīng)用前景 本項(xiàng)成果可作為CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的載體，廣泛應(yīng)用于基因編輯領(lǐng)域。03.知識產(chǎn)權(quán) 本項(xiàng)成果已申請1項(xiàng)發(fā)明專利。04.團(tuán)隊(duì)介紹 本項(xiàng)目為多團(tuán)隊(duì)合作項(xiàng)目，其中一個(gè)團(tuán)隊(duì)的負(fù)責(zé)人為清華大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，長江學(xué)者特聘教授，國家杰出青年基金獲得者。主要研究方向?yàn)楹铣缮飳W(xué)、微生物代謝工程、生物材料、工業(yè)生物技術(shù)。已發(fā)表國內(nèi)外高水平學(xué)術(shù)論文數(shù)十篇，申請專利70余項(xiàng)。05.合作方式 投融資。06.聯(lián)系方式郵箱：zhangxinrui@tsinghua.edu.cn

一種家蠶滯育品種的低溫催青轉(zhuǎn)基因方法。用特殊的催青條件改變家蠶滯育品種下一代蠶卵的化性,使 特殊的催青條件下獲得的當(dāng)代家蠶滯育品種蠶蛾交配，產(chǎn)下非滯育的下一代蠶卵，最后參照非滯育家蠶卵胚 胎顯微注射的轉(zhuǎn)基因方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因，從而巧妙地突破家蠶滯育品種轉(zhuǎn)基因技術(shù)的障礙并有效制作轉(zhuǎn)基因 蠶。該方法直接采用生產(chǎn)中普遍使用的實(shí)用性家蠶滯育品種作為原始材料，可以避免漫長而煩瑣的育種過 程，直接利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)造出各種性狀優(yōu)良的新的特殊家蠶品種，可大大縮短育種的周期，節(jié)約大量的人 力和物力。一種家蠶滯育品種的早期浸酸轉(zhuǎn)基因方法，利用在蠶卵胚胎發(fā)育至胚帶形成之前的一定時(shí)間內(nèi)， 即產(chǎn)卵后2個(gè)半小時(shí)之前對家蠶滯育卵進(jìn)行鹽酸的浸泡處理,隨后對處理解除滯育的蠶卵進(jìn)行風(fēng)臺(tái)顯微注射， 催青孵化獲得的GO代家蠶的飼養(yǎng)至化蛾，它們的自交或回交產(chǎn)生G1代，通過熒光標(biāo)記篩選，從而有效制作 轉(zhuǎn)基因家蠶。該方法直接采用生產(chǎn)中普遍使用的實(shí)用性家蠶滯育品種作為原始材料，可以避免漫長而煩瑣的 育種過程,直接利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)造出各種性狀優(yōu)良的新的特殊家蠶品種，可大大縮短育種的周期，節(jié)約大 量的人力和物力。

1. 痛點(diǎn)問題 紅球菌是具有高抗逆性（耐有機(jī)溶劑、耐高溫、耐酸堿）的特殊放線菌，日本30年前首先使用紅球菌高效催化丙烯腈水合生產(chǎn)丙烯酰胺——其聚合產(chǎn)物廣泛用于石油開采、水處理、土壤改良劑等領(lǐng)域——迄今為止仍是工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域最成功的案例之一。開發(fā)紅球菌基因編輯方法，一方面可以實(shí)現(xiàn)紅球菌細(xì)胞自身性能的按需調(diào)控（如敲除副產(chǎn)物基因），解決丙烯酰胺、丙烯酸銨等酰胺、羧酸類大宗/精細(xì)化學(xué)品生產(chǎn)中的高成本和高排放問題，另一方面有望以紅球菌細(xì)胞為普適性宿主，高表達(dá)各種外源功能酶，從而實(shí)現(xiàn)重組紅球菌全細(xì)胞催化技術(shù)的普遍應(yīng)用，尤其是解決手性醫(yī)藥中間體現(xiàn)有制備工藝中路線長、工藝復(fù)雜、原子經(jīng)濟(jì)性差、環(huán)境污染嚴(yán)重等各種主要問題。但是，作為一種革蘭氏陽性放線菌，紅色紅球菌存在基因組中GC含量高、基因轉(zhuǎn)化率低、非法重組嚴(yán)重等問題，基因組改造困難。目前紅色紅球菌基因組改造主要依賴于自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組，但自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率和單交換成功率很低，正確編輯率更低。因此，迫切需要開發(fā)高效的紅球菌基因組編輯工具。 2. 解決方案 本技術(shù)核心成果是一種基于CRISPR（成簇規(guī)律間隔短回文序列）-Cas9（DNA剪切蛋白）技術(shù)的紅色紅球菌基因組高效編輯方法。該技術(shù)通過紅色紅球菌特有啟動(dòng)子及質(zhì)粒元件，首先實(shí)現(xiàn)了Cas9蛋白在紅色紅球菌中的表達(dá)及切割功能；其次成功規(guī)避了紅球菌的限制修飾系統(tǒng)，將紅色紅球菌基因轉(zhuǎn)化效率提高了80多倍；接下來，又通過紅球菌重組酶的引入，顯著提高了外源基因在紅色紅球菌中的同源重組效率，最終率先成功建立紅色紅球菌的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，不僅可以實(shí)現(xiàn)基因組上目標(biāo)基因的敲除、替換和改造，也可實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因的同時(shí)敲除以及無痕疊加敲除，為紅球菌全細(xì)胞催化平臺(tái)技術(shù)開發(fā)及其在化學(xué)品綠色先進(jìn)制造中的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。 合作需求 開展合作開發(fā)、技術(shù)許可等，尋求有志于生物制藥、生物合成、石油開采、日化洗滌等不同應(yīng)用領(lǐng)域進(jìn)行紅球菌全細(xì)胞催化法生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)品的企業(yè)合作，尤其是在上述不同領(lǐng)域具有生產(chǎn)和銷售優(yōu)勢或經(jīng)驗(yàn)的企業(yè)。

選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因作物已成為近年來植物基因工程技術(shù)研究的重點(diǎn)之一，隨著轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)品的商品化，轉(zhuǎn)基因植物的生物安全性受到公眾越來越多的關(guān)注，尤其是目前抗生素標(biāo)記基因在植物遺傳轉(zhuǎn)化過程中的廣泛應(yīng)用，使人們對這些標(biāo)記基因可能帶來的潛在危害性心存疑慮，抗性標(biāo)記基因的存在嚴(yán)重地阻礙了轉(zhuǎn)基因植物的商品化進(jìn)程和轉(zhuǎn)化技術(shù)本身的有效性。 本項(xiàng)目培育的無抗生素標(biāo)記基因（可視化標(biāo)記基因）在建立高效、安全、規(guī)模化的轉(zhuǎn)基因作物技術(shù)體系方面取得突破，以紫色幼芽作為可視篩選標(biāo)記代替抗生素篩選標(biāo)記，構(gòu)建了新型轉(zhuǎn)化載體

本試驗(yàn)通過石蠟切片技術(shù)對湘軍金魚性腺組織進(jìn)行切片觀察，發(fā)現(xiàn)9月齡的雄性湘軍金魚精巢中有大量的成熟精子，11月齡的雌性湘軍金魚卵巢中有成熟卵子。 一、項(xiàng)目進(jìn)展 創(chuàng)意計(jì)劃階段 二、負(fù)責(zé)人及成員 姓名 學(xué)院/所學(xué)專業(yè) 入學(xué)/畢業(yè)時(shí)間 洪迪珊 湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/生物科學(xué) 2018/2022 陳雨薇 湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/生物技術(shù) 2018/2022 劉雨欣 湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/生物科學(xué) 2019/2023 馬彤彤 湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/生物科學(xué) 2019/2023 黃志嫻 湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/生物科學(xué) 2018/2022 三、指導(dǎo)教師 姓名 學(xué)院/所學(xué)專業(yè) 職務(wù)/職稱 研究方向 劉少軍 湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/魚類遺傳育種 教授 魚類遺傳育種 王余德 湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/魚類遺傳育種 講師 魚類遺傳育種 四、項(xiàng)目簡介 為探究湘軍金魚的胚胎發(fā)育過程、能育性、倍性以及Chordin A基因在湘軍金魚的雙尾性狀形成過程中的作用，本試驗(yàn)通過石蠟切片技術(shù)對湘軍金魚性腺組織進(jìn)行切片觀察，發(fā)現(xiàn)9月齡的雄性湘軍金魚精巢中有大量的成熟精子，11月齡的雌性湘軍金魚卵巢中有成熟卵子。試驗(yàn)通過PHA體內(nèi)誘導(dǎo)腎細(xì)胞制片法對湘軍金魚染色體數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)其染色體數(shù)目為100條。試驗(yàn)通過PCR技術(shù)獲得了Chordin A基因全長，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Chordin A基因全2634 bp，其中堿基A共618個(gè)，占比23.46%、堿基C共692個(gè)，占比26.27%、堿基G共756個(gè)，占比28.70%、堿基共568個(gè)，占比21.56%。堿基“G+C”占比 54.97%，堿基“A+T”占比45.03%。試驗(yàn)對湘軍金魚不同組織進(jìn)行Chordin A基因的熒光定量PCR試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Chordin A基因在尾鰭表達(dá)量最高。項(xiàng)目成員在進(jìn)行科學(xué)探究的同時(shí)深挖湘軍金魚經(jīng)濟(jì)價(jià)值，項(xiàng)目組成員多次赴雙峰縣、龍?zhí)镦?zhèn)玉坪村等地進(jìn)行實(shí)地調(diào)研,我們發(fā)現(xiàn)觀賞魚行業(yè)是朝陽行業(yè)，發(fā)展迅猛；與此同時(shí)湖南省休閑漁業(yè)來勢喜人，但是觀賞魚普遍魚病高發(fā)，變異物種破壞生態(tài)等問題。本項(xiàng)目借助湘軍金魚這一優(yōu)質(zhì)魚種，通過互聯(lián)網(wǎng)+農(nóng)副產(chǎn)品的銷售模式，變單一銷售模式為多形式利益聯(lián)合，拉動(dòng)當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)增長。我們與村落達(dá)成了長期合作的關(guān)系。湘軍金魚作為優(yōu)質(zhì)觀賞魚備受消費(fèi)者青睞。