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成果簡介： 近年來重金屬污染事件頻發，不僅嚴重阻礙經濟社會的良性發展，而且對人體健康造成不可逆轉的損害。我國是人均耕地資源短缺的國家，水、大氣等受體的污染物最終將會陸續轉移到土壤中，為保證糧食安全問題，2016年國務院印發了《土壤污染防治行動計劃》，簡稱“土十條”。本成果針對中國日趨嚴重的土壤重金屬污染問題，開展土壤重金屬污染生物修復關鍵技術研發與應用示

針對不合理施用肥料及集約化生產等導致的土壤生物退化，土壤生態系統調控能力下降，植物土傳病害加劇等問題，開展了農用功能微生物的篩選及其在農業廢棄物肥料化、土壤微生態修復調理、植物抑病促生等方面的研究。研究獲得200多株對10余種主要農作物土傳病原靶標菌有較強防病促生優良微生物菌株，開發出生防放線菌菌株3株、真菌1株、細菌2株。在此基礎上集成功能微生物高密度培養技術、土壤微生態系統的快速修復技術和微生物干預植物減害、生態友好技術。開發了放線菌高活性菌粉、放線菌有機肥和放線菌液體肥料等產品，并建立了相應生產線。該成果既能實現土壤生物退化及連作障礙的微生物修復，又能實現生產減肥減藥、產品提質增效；該成果實施后預期年生產菌劑固態6000噸，每噸售價20000元；液態5000噸，每噸售價15000元。

通過微生物育種和基因工程手段相結合，獲得了一株脯氨酸高產菌株黃色短桿菌。發酵培養 65~68 h， L-脯氨酸產量高達 100 g/L，葡萄糖得率為 45%左右。 關鍵技術 (1)本研究以玉米漿為氮源，有效的降低了發酵成本； (2)以葡萄糖和味精為原料生產 L-脯氨酸的高轉化率發酵，該法綠色、環保、可持續，具有經濟競爭力，有很好的產業應用前景。

結合文獻調研和數據庫檢索，選擇 L-氨基酸脫氨酶在大腸桿菌中進行異源表達，對菌株進行發酵條件優化和轉化條件優化，并對野生型 L-氨基酸脫氨酶進行蛋白質工程改造，一定程度上減輕了產物抑制作用，產量和轉化率都有所提高。主要技術指標：濕菌體 15g/L，底物 L-纈氨酸 100 g/L，α-酮異戊酸產量為 95.6 g/L，轉化率為 96.4%。 關鍵技術 (1)以大腸桿菌為宿主，生長快，周期短，催化效率高； (2)對野生型 L-氨基酸脫氨酶進行蛋白質工程改造，一定程度上減輕了產物抑制作用，產量和轉化率都有所提高； (3)微生物轉化具有專一性強、條件溫和的優點，該法綠色、環保、可持續，具有經濟競爭力，有很好的產業應用前景。 

谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase , GAD)能專一地催化 L-谷氨酸裂解為γ-氨基丁酸和 CO2 的作用，以發酵培養的全細胞或酶液作為催化劑轉化生產γ-氨基丁酸，所需設備簡單，條件容易控制，轉化體系雜質含量少，收率高，環境友好。本技術方法通過蛋白質工程改造和基因工程手段構建了高產谷氨酸脫 羧酶的突變株，經培養后，轉化體系中添加濕菌體 10 g/L，以分批補料添加谷氨酸，轉化 7 h，γ-氨基丁酸產量為 425.0 g/L，摩爾轉化率達到 98%，γ-氨基丁酸生產強度達到 60.7 g/(L?h)。 關鍵技術 (1) 以大腸桿菌為宿主，生長快，周期短，催化效率高； (2)以廉價的富馬酸為底物生產高附加值β-丙氨酸，成本低，收益高； (3)微生物轉化具有專一性強、條件溫和的優點，該法綠色、環保、可持續， 具有經濟競爭力，有很好的產業應用前景

浮游植物在表層獲取光能固定CO2，形成顆粒有機碳（POC）往下沉降，在深海再礦化后生成銨（NH4+），從而為深海化能自養細菌/古菌提供了能量來源。因此，氨氧化古菌和亞硝氧化細菌所介導的兩步硝化過程是實現光能傳遞到深海被利用的重要途徑，是深海重要的供能過程，支撐了海洋“黑暗固碳”——不依賴于光合作用的化能自養固碳，為深海生物圈提供了“新”的有機質，同時積累硝氮。由于亞硝氧化菌群研究的長期滯后，氨氧化和亞硝氧化功能群在深海的協作關系始終不明了，因此國際上對深海硝化菌群支撐的碳（C）−氮（N）耦合機理（定性）的理解仍極為有限，對C−N計量學關系（定量）的準確估算仍是空白。 該研究工作結合多組學分析、生理學實驗、現場原位速率及動力學觀測和模擬，以及生態系統模型，闡釋了氨氧化古菌和亞硝氧化細菌顯著差異的代謝策略，及兩步氧化過程耦合、硝化與黑暗固碳耦合的生理生態學機制，建立了硝化菌群支撐的C−N、物質與能量轉換的計量學關系，量化了深海硝化過程對深海生物圈及全球海洋碳循環的貢獻和影響。該工作為深海物質與能量循環研究提供了新的參數，對深入認識深海生物地球化學過程具有重要意義。

項目成果/簡介:浮游植物在表層獲取光能固定CO2，形成顆粒有機碳（POC）往下沉降，在深海再礦化后生成銨（NH4+），從而為深海化能自養細菌/古菌提供了能量來源。因此，氨氧化古菌和亞硝氧化細菌所介導的兩步硝化過程是實現光能傳遞到深海被利用的重要途徑，是深海重要的供能過程，支撐了海洋“黑暗固碳”——不依賴于光合作用的化能自養固碳，為深海生物圈提供了“新”的有機質，同時積累硝氮。由于亞硝氧化菌群研究的長期滯后，氨氧化和亞硝氧化功能群在深海的協作關系始終不明了，因此國際上對深海硝化菌群支撐的碳（C）?氮（N）耦合機理（定性）的理解仍極為有限，對C?N計量學關系（定量）的準確估算仍是空白。 該研究工作結合多組學分析、生理學實驗、現場原位速率及動力學觀測和模擬，以及生態系統模型，闡釋了氨氧化古菌和亞硝氧化細菌顯著差異的代謝策略，及兩步氧化過程耦合、硝化與黑暗固碳耦合的生理生態學機制，建立了硝化菌群支撐的C?N、物質與能量轉換的計量學關系，量化了深海硝化過程對深海生物圈及全球海洋碳循環的貢獻和影響。該工作為深海物質與能量循環研究提供了新的參數，對深入認識深海生物地球化學過程具有重要意義。

本成果總體達到同類研究的國際先進水平，在獸醫微生物菌毒種資源規范性描述方 面處于國際領先水平，在獸醫微生物菌毒種資源的篩選和創新性應用等方面處于國際先 進水平。本成果于2009年獲得成果鑒定證書，獲得2010年度山東省科技進步獎二等獎。 本成果分離鑒定了具有平臺資源號的280株細菌。其中，大腸桿菌80株，金黃色葡 萄球菌30株，豬鏈球菌50株，雞傷寒沙門氏菌103株，特殊菌株17株。分離鑒定了186株 病毒，其中NDV 60株，豬繁殖與呼吸綜合征病毒50株，犬瘟熱病毒3株，豬傳染性胃腸 炎病毒10株，豬流感病毒3株，禽流感病毒20株，雞傳染性支氣管炎病毒20株，雞傳染 性法氏囊病毒20株。對分離、收集和整理以前所保藏的菌毒種等方式獲得的33種3444株 菌毒種進行標準化整理整合，完成了相應菌毒種種資源數據信息（包括個性信息和共性 信息）的采集、錄入、上報，完成280幅圖像信息采集、整理、上報，完成101株菌（毒） 種資源16SrRNA或病毒資源部分核酸序列的測定、上報。并向國家獸醫微生物菌種保藏 管理中心國家獸醫微生物標準菌種保藏庫上交了1621株菌（毒）種，實現了獸醫微生物 菌毒種資源的信息及實物共享。起草了“布魯氏桿菌菌種資源描述規范”和“牛結核桿 菌資源檢測技術規程”，驗證完善了“結核桿菌菌種資源檢測技術規程及試點應用”等 9個獸醫微生物資源檢測技術規程。制定了“犬瘟熱診斷技術”的國家標準。對分離的 部分菌毒株進行生物學特性研究，為相關單位的科學研究提供了優良菌毒種。

威蘭膠是一種性能優良的微生物多糖，性質與黃原膠相似，同時存在同類多糖不可比擬的優勢：1、在更大的范圍內具有熱穩定性，可以耐受150℃的高溫；2、pH耐受范圍廣，在pH2.0-13.0的范圍內性質穩定；3、耐鹽性好。威蘭膠的耐溫特性在深層采油中十分重要，目前油井深度已達3000米以上，對采油驅動劑耐溫要求大于140℃，因此威蘭膠的耐溫優勢以及它的一些獨特性能，使它有望成為一種性能更為優良的驅油制劑。威蘭膠是一種不可多得的混凝土外加劑，可以增加水泥的可塑性，懸浮量，空氣含量，抗下陷能力以及抗失水性。威蘭膠是制備自密實混凝土和自流平混凝土不可缺少的添加劑。按每噸混凝土中添加0.01%的威蘭膠，則成本僅增加10塊錢左右。我國在這一領域的應用全部依賴進口。本課題組擁有一株自主知識產權的生產菌株，并率先在國內開展了發酵法生產威蘭膠的研究。本項目的成功開發將具有我國自主知識產權，對石油、混凝土等相關行業的發展具有積極的意義。威蘭膠的生產基本可以利用黃原膠的生產資源，因此實驗室中試成熟后，廠家無需太多的前期投入就可以實現工業化。

γ-聚谷氨酸（Poly-γ-glutamic acid）是一種重要的天然聚合物，由 于其具有良好的性質已被廣泛應用于食品，化妝品，醫藥，材料等領 域。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）LL3 是一株谷氨酸 非依賴型 γ-PGA 合成菌。為了提高其 γ-PGA 產量，項目組采用無痕 基因編輯技術對菌株進行了代謝工程改造。包括三部分：模塊化代謝 通路改造；蔗糖代謝途徑改造；谷氨酸合成途徑改造。 B. amyloliquefaciens LL3 是項目組從發酵食品中分離得到，它能 夠從蔗糖出發合成 γ-PGA。利用模塊化通路改造策略對 γ-PGA 合成 相關的八個代謝通路進行改造包括：γ-PGA 降解相關途徑；細胞呼吸 鏈；胞外蛋白及胞外蛋白酶合成途徑；細菌多糖合成途徑；次級小分 子代謝產物合成途徑；細胞自誘導因子合成途徑；谷氨酸合成途徑以 及 γ-PGA 合成途徑。最終整合獲得的最優基因工程菌株 NK-anti-rocG （敲除了 epsA-O 操縱子（負責胞外多糖合成），sac 操縱子（負責果 聚糖合成），lps（脂多糖合成相關），pta（乙酸合成相關），pgdS（γ-PGA 降解酶），cwlO（細胞壁水解酶），luxS（AI-2 合成）以及表達 anti-rocG sRNA（抑制谷氨酸脫氫酶表達））γ-PGA 搖瓶發酵產量從 3.8 g/L 提高到 11.04 g/L，較對照菌株提高了 2.91 倍。γ-PGA 產物純度也 從 78.6%提高到 95.2%。5-L 罐補料分批發酵實驗得到 NK-anti-rocG 菌株產量可達 20.3 g/L。分子量 450,000 Dal，純度 95%以上。 項目特色： 1. 菌種（Bacillus amyloliquefaciens）LL3 是谷氨酸非依賴型 γ-聚谷 氨酸合成菌株；發酵生產主要原料為蔗糖； 2. 補料分批發酵產量為：20.3 g/L。 3. 授權專利號為：ZL200810053900.7 市場應用前景： γ-聚谷氨酸（Poly-γ-glutamic acid）是一種重要的天然聚合物，由 于其具有良好的性質已被廣泛應用于食品，化妝品，醫藥，材料等領 域。本項目采用谷氨酸非依賴型 γ-聚谷氨酸合成菌做為發酵菌種，以 蔗糖為原料發酵法生產 γ-聚谷氨酸，可產生巨大的經濟效益和社會效 益。