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本發(fā)明涉及豬ApoE基因敲除載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，本發(fā)明的載體命名為pApoEKO-DTA-M，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO : 1所示，其構(gòu)建方法包括如下步驟：(1)擴(kuò)增豬ApoE基因側(cè)翼序列作為基因打靶的長臂和短臂；(2)短臂與打靶載體ploxp分別酶切、連接后，再與長臂連接；去除tk，與dta基因片段連接；(3)在長短臂之間插入特異性啟動(dòng)子Cre，構(gòu)建得到ApoE基因敲除載體。本發(fā)明的豬ApoE基因敲除載體可用于培育敲除了ApoE基因的豬，用于動(dòng)脈硬化模型動(dòng)物的制備。

        我國精神疾病發(fā)病率高且增長趨勢明顯，是我國推進(jìn)國民大健康戰(zhàn)略所面臨的巨大挑戰(zhàn)。然而當(dāng)前精神疾病臨床診斷缺乏發(fā)病機(jī)制的依據(jù)，主要以臨床表型為指標(biāo)。多數(shù)精神疾病的發(fā)病原因與人體基因新發(fā)突變相關(guān)，這種不在父代而僅在子代發(fā)生的基因變異對精神疾病的臨床診療極具重要性。         研發(fā)團(tuán)隊(duì)建立了從患者新發(fā)突變基因組學(xué)到轉(zhuǎn)錄組、蛋白組學(xué)的完整生物組學(xué)發(fā)病機(jī)制臨床輔助診斷系統(tǒng)，填補(bǔ)了精神疾病臨床診斷的組學(xué)機(jī)制評(píng)價(jià)空白，系統(tǒng)自動(dòng)生成輔助診斷報(bào)告和用藥風(fēng)險(xiǎn)分析，具有顯著的臨床應(yīng)用價(jià)值，符合領(lǐng)域發(fā)展的國際行業(yè)趨勢，具有巨大的市場推廣潛力。         意向開展成果轉(zhuǎn)化的前提條件：中試放大及產(chǎn)業(yè)化工藝開發(fā)資金支持

可以量產(chǎn)/n該成果屬于基因表達(dá)分析技術(shù)領(lǐng)域，公開了CmEF1α基因和CmRAN基因在分析甜瓜果實(shí)的基因表達(dá)時(shí)作為內(nèi)參基因的應(yīng)用，本發(fā)明還公開了一種采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析甜瓜果實(shí)基因表達(dá)的方法，它是將CmEF1α基因和CmRAN基因組合的幾何平均數(shù)作為甜瓜果實(shí)基因表達(dá)分析中的內(nèi)參基因。CmEF1α基因和CmRAN基因在不同坐果方式的甜瓜果實(shí)的不同發(fā)育階段均能穩(wěn)定表達(dá)，是甜瓜果實(shí)發(fā)育過程中利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測基因表達(dá)分析的可靠內(nèi)參基因組合。該成果具有可靠性和實(shí)用性，能夠顯著提

該成果榮獲2009年度重慶市自然科學(xué)獎(jiǎng)一等獎(jiǎng),項(xiàng)目建成了世界最大和最豐富的家蠶突變基因資源庫, 共保存遺傳系統(tǒng)700余個(gè)，覆蓋國際現(xiàn)存的95% ;新建立家蠶資源系統(tǒng)400個(gè);發(fā)現(xiàn)新突變基因60余個(gè)，占 同期國內(nèi)90%以上、國際70%以上。通過對重要突變基因資源的研究取得了重要?jiǎng)?chuàng)新結(jié)果，包括闡明65個(gè)新 突變基因的遺傳模式，確定了50個(gè)的所屬連鎖群（染色體）,定位40個(gè)基因；建立了27連鎖群的標(biāo)記基因; 建立了230多個(gè)形態(tài)基因的連鎖標(biāo)記體系等。構(gòu)建了世界第一套完整的家蠶近等位基因系，首次建立了3個(gè)重 要品系高純度近交系，繪制了家蠶SADF. RAPD, AFLP. SSR等分子連鎖圖譜6張，構(gòu)圖分子標(biāo)記2756 個(gè)，繭質(zhì)性狀QTLsll個(gè)，研究了一批重要突變基因的功能等。項(xiàng)目所取得的研究成果使我國家蠶遺傳資源研 究整體上達(dá)到國際領(lǐng)先水平,并為我國蠶業(yè)科學(xué)研究提供了強(qiáng)大的資源支撐。目前每年有大約50個(gè)機(jī)構(gòu)索取 基因庫資源進(jìn)行科學(xué)研究，年使用頻率超過500份次。家蠶基因資源庫建立和突變基因研究奠定了蠶學(xué)基礎(chǔ) 研究、產(chǎn)業(yè)研發(fā)、高層次人才培養(yǎng)的重要基礎(chǔ)，將對家蠶功能基因組學(xué)、實(shí)驗(yàn)生物和鱗翅目害蟲模式等前沿 研究產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。

該技術(shù)可利用人體自身存在的機(jī)制進(jìn)行RNA的單堿基編輯，避免了任何由于表達(dá)外源效應(yīng)蛋白而引起的潛在問題。 新型基因編輯技術(shù)（魏文勝團(tuán)隊(duì)） 　　LEAPER (Leveraging Endogenous ADAR for Programmable Editing on RNA)是一類具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型基因編輯技術(shù)，該技術(shù)可利用人體自身存在的機(jī)制進(jìn)行RNA的單堿基編輯，避免了任何由于表達(dá)外源效應(yīng)蛋白而引起的潛在問題。LEAPER技術(shù)具有高精度、易于遞送、長時(shí)效、高安全性等多種優(yōu)點(diǎn)，并在包括遺傳性疾病治療方面展現(xiàn)出了可觀的優(yōu)勢及潛能，成功為生命科學(xué)基礎(chǔ)研究和疾病治療提供了一種全新的工具。 　　 LEAPER技術(shù)原理 　　近年來，以CRISPR/Cas9為代表的基因組編輯技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響，但存在的一系列問題使該技術(shù)在臨床治療應(yīng)用中遭遇瓶頸。根源之一在于當(dāng)前的基因編輯體系依賴于外源編輯酶或效應(yīng)蛋白的表達(dá)，從而造成 (1) 蛋白分子量過大使得通過病毒載體進(jìn)行裝載及人體內(nèi)遞送十分困難；(2) 由蛋白過表達(dá)引起的DNA/RNA水平的脫靶效應(yīng)；(3) 由外源蛋白表達(dá)引起的機(jī)體免疫反應(yīng)及損傷；(4) 機(jī)體內(nèi)的預(yù)存抗體使外源編輯酶或效應(yīng)蛋白被中和從而導(dǎo)致基因編輯失敗等。 　　為解決上述問題，擺脫傳統(tǒng)技術(shù)依賴于外源蛋白表達(dá)的桎梏，2019年魏文勝團(tuán)隊(duì)建立了具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的名為LEAPER的新型基因編輯技術(shù)。與RNAi類似，LEAPER充分利用了細(xì)胞中天然存在的機(jī)制：僅用一條RNA 就實(shí)現(xiàn)了精確高效的RNA單堿基編輯，從而避免了任何由于表達(dá)外源效應(yīng)蛋白而引起的各種潛在問題。研究人員利用LEAPER成功修復(fù)了來源于Hurler綜合征病人的缺陷細(xì)胞，為未來相關(guān)疾病的治療奠定基礎(chǔ)。此外，LEAPER還有希望衍生出多種延展型技術(shù)，為生物醫(yī)學(xué)等研究提供新型工具。

/space電泳技術(shù)是目前檢測PCR產(chǎn)物的有效方法。電泳技術(shù)主要包括毛細(xì)管電泳技術(shù)與平板凝膠電泳技術(shù)。毛細(xì)管電泳技術(shù)雖具有靈敏度高、檢測速度快、實(shí)驗(yàn)試劑耗量少等優(yōu)勢，但是其高昂的價(jià)格限制了其在實(shí)驗(yàn)室的進(jìn)一步推廣。平板凝電泳技術(shù)憑借其價(jià)格優(yōu)勢成為實(shí)驗(yàn)室檢測DNA最常見的方法。傳統(tǒng)凝膠電泳技術(shù)主要包括制膠、進(jìn)樣、電泳、染色及成像五個(gè)步驟，所涉及設(shè)備主要包括制膠槽、電泳槽、微波爐，直流電源、搖床及凝膠成像儀等。

南開大學(xué)在天津市科技發(fā)展計(jì)劃科技攻關(guān)項(xiàng)目《建立和應(yīng)用腫瘤 轉(zhuǎn)移相關(guān)基因生物芯片篩選抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的研究》的資助下，進(jìn)行 了腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因生物芯片的研究，在設(shè)計(jì)探針后，完成制備了含 有 213 個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的基因芯片。 應(yīng)用上述基因芯片所進(jìn)行的大量的研究工作，表明該基因芯片有很好的應(yīng)用前景。由于該基因芯片的成本低于全基因組芯片，有利于 大量推廣使用。與科研機(jī)構(gòu)、醫(yī)院和藥廠等相關(guān)企業(yè)合作，大量制備 該基因芯片，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，投放市場使用，可實(shí)現(xiàn)良好的社會(huì)和經(jīng)濟(jì) 效益。 應(yīng)用價(jià)值： 基礎(chǔ)研究：可應(yīng)用該基因芯片進(jìn)行腫瘤轉(zhuǎn)移分子機(jī)制的基礎(chǔ)研究， 篩選與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。 應(yīng)用研究：可應(yīng)用該基因芯片篩選抗腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物；在臨床上 對切除的腫瘤組織進(jìn)行檢測，進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上檢測對不同 化療藥物的敏感性，為臨床治療方案提供依據(jù)

交叉集成上海交通大學(xué)在材料科學(xué)與其他科學(xué)與工程領(lǐng)域的綜合優(yōu)勢，協(xié)同發(fā)展基于材料基因組理念的材料學(xué)理論與計(jì)算、實(shí)驗(yàn)、數(shù)據(jù)技術(shù)，加速創(chuàng)新在新模式下材料研究與應(yīng)用。牽頭建立校級(jí)“上海交通大學(xué)材料基因組聯(lián)合研究中心”學(xué)科交叉平臺(tái)；與MIT的Gerberd Ceder教授合作共建基于The Matenals Project的材料基因組亞洲中心；作為主要成員參與共建“上海市材料基因組工程研究院”；聯(lián)合上海同步輻射光源共建“材料高通量原位制備和表征線站”

TK基因突變試驗(yàn)具有高度的敏感性，可檢出包括點(diǎn)突變、大的缺失、重組、異倍性和其他較大范圍基因組改變在內(nèi)的許多遺傳改變，長時(shí)間處理還可檢出某些斷裂劑、紡錘體毒物和多倍體誘導(dǎo)劑等。近年來，本團(tuán)隊(duì)在使用L5178Y細(xì)胞和TK6細(xì)胞系用于TK基因突變試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化方面做了大量的研究工作，在國內(nèi)外期刊上發(fā)表了多篇文章。并在國內(nèi)負(fù)責(zé)制定/修訂了TK基因突變試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)在2003年第一次頒布，2012年開始修訂，目前修訂版將于2014年末正式頒布，作為《GB15193 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)—食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序》中體外遺傳毒性重要的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，對評(píng)價(jià)受試物的遺傳毒性具有重要作用。