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解析致病菌細胞壁成分胞壁酸翻轉酶結構功能機制
中國科大陳宇星教授、周叢照教授和孫林峰教授課題組合作闡明了金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）胞壁酸（WTA）翻轉酶TarGH轉運WTA的機制和TarGH特異性抑制劑Targocil的抑制機制。該研究成果在線發表在微生物領域專業雜志mBio上。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是主要的臨床致病菌之一，其引發的感染難以治愈甚至可能致死。由于近年來抗生素濫用，出現了對所有的β-內酰胺類藥物都具有抗性的MRSA菌株。研究表明S. aureus細胞壁主要成分WTA是引起耐藥性的關鍵因素之一。在革蘭氏陽性菌中，WTA是一類共價連接在肽聚糖上的陰離子多聚物。WTA在細菌分裂、生物膜形成、宿主定殖以及細菌感染等過程中起著重要作用。因此，WTA合成路徑中的關鍵酶是新型抗菌藥物的重要靶點。在S. aureus中，WTA合成前體是N-乙酰葡糖胺修飾的多聚核糖醇長鏈，其通過共價鍵連接在錨定在細胞膜上的脂質載體Und-PP上。該Und-PP連接的多聚核糖醇長鏈前體先在細胞內完成合成，最后通過ABC轉運蛋白TarGH翻轉出細胞膜。作為最具潛力的抗生素靶標之一，TarGH及其抑制劑得到廣泛研究。先導化合物小分子Targocil是近期被鑒定出來特異性抑制TarGH效率較高的抑制劑，但是其抑制的分子機制并不清楚。為闡明TarGH轉運WTA的機理以及Targocil的抑制機制，作者用冷凍電鏡方法，解析了金黃色葡萄球菌WTA翻轉酶TarGH的同源蛋白，來自Alicyclobacillus herbarius菌的TarGH結構。其同源性為50%。TarGH結構總體分辨率為3.9 ?，其核心結構區域分辨率達到3.6?。由于未結合ATP，TarGH結構處于開口朝向細胞內的構象狀態。基于結構，作者計算出了底物轉運通道，通過對組成通道的氨基酸殘基性質分析并結合生理實驗，闡明了底物特異性識別機制。通過結構比對作者提出TarGH及其同源蛋白利用“曲柄連桿”原理來實現底物轉運的分子機制。具有類似結構特點的ABC轉運蛋白都可以利用這一機制通過相對微小的總體構象變化轉運較大的底物。作者進一步通過生化實驗和計算機模擬確定了Targocil結合TarGH的精確位點，并闡明了其抑制TarGH轉運胞壁酸的分子機制。
中國科學技術大學
2021-04-10
重組大腸桿菌生產磷脂酶D及轉酯化產品開發
"磷脂酶 D （PLD）是一類具有水解作用和磷酰基轉移作用的酶, 在磷脂改性方面發揮著重要作用。它可以將大量磷脂酰膽堿(PC) 催化合成為自然界稀有的磷脂質，如磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)和磷脂酰甘油(PG)等，合成的磷脂質在醫藥和食品工業具有很大的應用前景。但由于來源不足和價格高，PLD的工業應用一直受到限制。本項目通過基因工程和微生物發酵技術，解決了PLD工業化應用中難表達和表達量不足的難題，利用重組大腸桿菌發酵實現了PLD的高水平表達，其酶活為106 U?L-1，產量為748 mg?L-1，分別比目前報道的最高水平提高了100倍和20倍；同時，本項目還建立了一種簡單有效提取重組PLD的方法，可望大大降低PLD的生產成本。本技術先進，應用前景看好，如按106 U?L-1的發酵水平生產，成本約100元人民幣/1000 U，目前市場售價在3000-6000元/1000 U，利潤空間很大。 "
廈門大學
2021-04-10
一種α-半乳糖苷酶軟膠囊飼料添加劑
其他成果/n本發明屬于飼料添加劑技術領域，具體涉及一種α-半乳糖苷酶軟膠囊飼料添加劑及其制備方法。該方法包括以下步驟：1)向磷酸鹽緩沖溶液中加入α-Gal，然后加入β-CD，再經過均質后靜置反應，至反應終點，得到α-Gal—β-CD添加液；2)將B型明膠加入水中，充分溶脹后加入甘油、防腐劑和二氧化鈦，混合均勻進行膠化，得到膠料；3)灌裝。通過本發明得到的軟膠囊添加劑利用環糊精抑制劑對α-Gal的抑制作用，使動物飼料中的α-Gal酶活，經歷一個先低后高的過程，從而使飼料中的α-Gal在更合適的消化時期發揮催化作用。
武漢輕工大學
2021-04-11
生物酶法制備納米級功能性膳食纖維技術
本技術采用花生殼、小麥麩皮、大豆皮等農副產物為原料制備 納米纖維素。首次采用生物酶結合超聲波技術以農副產品為原材料制備納米級 膳食纖維，克服了目前酸法制備納米級膳食纖維污染重、周期長等缺點，建立 了一種高效、綠色、環保制備納米級膳食纖維的新方法；首次開發出納米級膳 食纖維及高纖維食品：包括面制品、淀粉制品、肉制品及功能性飲料制品等， 拓展了納米級膳食纖維的應用范圍。本項目所開發的納米級膳食纖維功能性食 品，兼具優良口感與保健功效，具有良好的市場前景，對建設資源節約型和環 境友好型社會具有重要的促進作用。 生產條件及經濟效益預測：納米膳食纖維素的初步市場估價為 15 萬元/噸。 項目投產后，年加工量 2000 噸的農副產物生產線，估算投資額為 8000 萬，可 產生經濟效益 2.55 億元，實現利稅 1.2 萬元。年加工量 1000 噸的農副產物生 產線，估算投資額為 4000 萬，可產生經濟效益 1.275 億元，實現利稅 8400 萬 元；年加工量 500 噸的農副產物生產線，估算投資額為 2000 萬，可產生經濟效 益 6375 萬元，實現利稅 3200 萬元。
青島農業大學
2021-04-11
速生闊葉材制漿造紙過程酶催化關鍵技術及應用
我國是世界上第一造紙大國，紙和紙板產量已超過全球總產量的25%。但我國木材資源匱乏，充分利用速生闊葉材資源、采用高效清潔制漿造紙技術是從根本上解決我國造紙工業面臨的資源與環境問題的有效途徑。陳嘉川教授領銜的科研團隊在973計劃和國家科技支撐計劃等資助下，歷經10余年，自主研究開發了酶促磨漿技術、酶促消潛技術、酶助漂白技術、酶精制紙漿技術等一系列制漿造紙酶催化綠色新技術，在降低磨漿能耗、消除有毒物污染、提升紙漿品質、改善抄造性能和研發高檔紙基新材料等方面取得了突破，實現了國產木材資源的高效高值化利用。
先后在世界造紙十強企業山東晨鳴紙業集團和國內龍頭企業山東太陽紙業股份有限公司等20余家骨干企業推廣應用，用生物酶催化技術生產出了優質木漿，并用于高級紙基材料的生產，實現了速生闊葉材的高效高值化利用，并產生了重大的經濟效益和社會效益。過2012-2014三年時間累計實現新增銷售額130.1億元，利潤25.6億元。
齊魯工業大學
2021-04-22
茶樹咖啡堿合成酶基因啟動子TCSP及其應用
本發明提供茶樹咖啡堿合成酶基因啟動子TCSP及其在制備轉基因植物中的應用.本發明以茶樹DNA為模板,用GenomeWalking方法克隆得到茶樹TCS基因啟動子序列,然后利用Gateway技術構建重組植物表達載體pKGWFS7TCSP,采用農桿菌介導的煙草遺傳轉化,以表達GUS基因的方式進行啟動子活性功能驗證.本發明首次從茶樹中克隆出特異性咖啡堿合成酶基因啟動子TCSP,并驗證了其活性,對于揭示茶樹咖啡堿合成的機理,生物調控茶樹咖啡堿的含量具有重要意義.
安徽農業大學
2021-04-29
關于蛋白質訂書機酶實現高效多肽-多肽偶聯反應
高效的 多肽 - 多肽偶聯反應對于 制備蛋白 - 藥物綴合物、調控蛋白質拓撲結構、生物成像 、化學生物學 等 領域 具有重要的意義 ，并因其可基因編碼的特性 而 備受關注 。目前， 研究 報道 此類連接方法 并不太多 見 ，其中 分選酶（ sortase ） 或 蝶豆粘酶 -1 （ butelase 1 ） 介導的偶聯反應具有較好的底物 序列特異性 ， 內含肽 （ intein ） 介導的蛋白質連接方法 可實現 可基因編碼的高效主鏈連接， 而 轉谷氨酰胺酶 （ transglutaminase ） 則 可以 介導 非特異性的 側鏈異肽鍵 偶聯 。近年來 ， 多肽 - 蛋白質反應對 的 蓬勃發展 為此類工具 的 發展 提供了新的契機 。 已 有 諜連接酶（ SpyLigase ）和探連接酶（ SnoopLigase ） 介導 的多肽 - 多肽偶聯體系 見諸報道 ，但其效率仍 有 待提高， 而 其 細 胞內的應用前景仍有待探索。 最近 ， 張文彬課題組發展了 獨特的具有無序結構的 諜訂書機 酶 （ SpyStapler ），可實現 諜標簽 （ SpyTag ）和北大 標簽 （ BDTag ）在 細 胞內和 細 胞外的高效偶聯 （圖 1 ） 。
北京大學
2021-04-11
一種具有增強的抑菌效果的噬菌體裂解酶
本發明將裂解酶Bp7e氨基酸的第99位亮氨酸和102位蛋氨酸分別進行突變為丙氨酸和谷氨酸，經原核表達技術得到了突變體蛋白并經Western-blot對其進行了鑒定，命名為Bp7c突變體蛋白。對Bp7e和Bp7e突變體蛋白進行了純化及濃度測定，通過體外裂解實驗及裂解譜檢測得知，純化的Bp7e和Bp7e突變體兩種蛋白具有廣譜的抑菌作用，對溶壁微球菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和多種血清型大腸桿菌均有裂解效果，且Bp7e突變體裂解效果整體優于天然裂解酶Bp7e。
青島農業大學
2021-04-13
自然界中首例 [6+4] 環加成反應的酶
鑒定首個高階環加成酶，拓展了環加成酶的認知
一、項目分類
重大科學前沿創新
二、成果簡介
南京大學化學化工學院梁勇教授，生命科學學院譚仁祥教授和戈惠明教授的科研團隊，發現了抗幽門螺旋桿菌的潛在藥物-漢城霉素并對其生物合成途徑進行深入研究。通過多菌株基因組序列比對，對漢城霉素類生物合成基因簇進行了鑒定，利用微生物學，分子生物學、底物化學衍生化、體外酶促反應等手段從該基因簇中鑒定出一個新穎、可催化高階環加成反應的酶。團隊基于蛋白質晶體數據，量子化學計算和蛋白質定點突變技術，對該酶促動力學過程進行了深入解析，最終確定該酶通過“雙過渡態”來同時催化產生6+4和4+2環加成產物。該特殊高階環加成酶的發現，解答了“自然界中是否存在酶催化的高階環加成反應”，這一持續五十余年的謎題。這類酶的發現將進一步拓展人們對周環反應酶的認識，啟發科學家們將來利用和改造周環反應酶來實現有價值的分子轉化。
成果于2019年4月以Letter形式發表于Nature。F1000評述該研究“鑒定首個高階環加成酶，拓展了環加成酶的認知”，諾貝獎得主霍夫曼評述“這是在酶促反應中直接觀察到的[6+4]環加成產物的首個例子……，該研究對酶促高階環加成研究具有深遠影響”。
南京大學
2022-08-12
重組大腸桿菌生產磷脂酶D及轉酯化產品開發
磷脂酶D（PLD,EC 3.1.4.4）是一類廣泛存在于各種生物體的酶，具有水解作用和磷酰基轉移作用（見圖1）。作為一種酶制劑，PLD的轉磷脂酰活性尤為重要，被用于制備具有生物活性的稀有磷脂。其中，以大豆磷脂酰膽堿（PC）為底物，PLD酶法制備磷脂酰絲氨酸（PS），受到廣泛關注。PS作為腦健康營養補充劑，相繼被美國FDA、日本HBM和中國國家衛生計生委所認證，列為新資源食品。相較于提取自牛腦和植物的PS，生物酶法制備的PS，避免了食品安全和植物源含量低的問題。進一步，一些新的結構和功能磷脂，通過PLD轉磷脂酰反應被合成出來，例如，磷脂酰鯊肝醇、磷脂酰葡萄糖、心磷脂類似物、磷脂酰酪醇、磷脂酰萜烯和磷脂酰絲氨醇，它們中一些具有抗癌和抗氧化活性。
直到現在，受限于磷脂酶D來源不足和價格高（鏈霉菌屬PLD，≥150 units/mg，6516.9¥/1000 U，Sigma公司），其工業上的廣泛應用受到限制。例如，文獻報道的PLD最高產量在104-105U·L-1，而制備轉化得到每公斤PS，需要2.6×106U的PLD。這一障礙的主要原因是高水平表達的PLD對宿主的嚴重細胞毒性，導致細胞死亡。
歷經5年時間，從上游到下游整體設計，我們解決了毒性蛋白（磷脂酶D，PLD）異源表達難的問題（質粒不穩定、蛋白合成時間短、細胞生長抑制和裂解），PLD生產達到目前世界最高水平106U·L-1(748 mg·L-1)（提高20倍）；同時發展一種簡單有效提取重組磷脂酶D的方法（無需破碎、無需添加溶菌酶和有機溶劑、室溫進行），PLD生產成本有望降低20倍以上。按照實驗室規模的一臺5 L發酵罐，年產量可以提供3.5×108U的磷脂酶D，滿足100 kg的PS轉化需求計算（不計算PLD重復利用率），擴大反應器體積至100-1000 L，PLD產量可滿足制備2-20噸PS的需求。
廈門大學
2021-01-12