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本發(fā)明將裂解酶Bp7e氨基酸的第99位亮氨酸和102位蛋氨酸分別進(jìn)行突變?yōu)楸彼岷凸劝彼幔?jīng)原核表達(dá)技術(shù)得到了突變體蛋白并經(jīng)Western-blot對(duì)其進(jìn)行了鑒定，命名為Bp7c突變體蛋白。對(duì)Bp7e和Bp7e突變體蛋白進(jìn)行了純化及濃度測(cè)定，通過(guò)體外裂解實(shí)驗(yàn)及裂解譜檢測(cè)得知，純化的Bp7e和Bp7e突變體兩種蛋白具有廣譜的抑菌作用，對(duì)溶壁微球菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和多種血清型大腸桿菌均有裂解效果，且Bp7e突變體裂解效果整體優(yōu)于天然裂解酶Bp7e。

鑒定首個(gè)高階環(huán)加成酶，拓展了環(huán)加成酶的認(rèn)知 一、項(xiàng)目分類 重大科學(xué)前沿創(chuàng)新 二、成果簡(jiǎn)介 南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院梁勇教授，生命科學(xué)學(xué)院譚仁祥教授和戈惠明教授的科研團(tuán)隊(duì)，發(fā)現(xiàn)了抗幽門螺旋桿菌的潛在藥物-漢城霉素并對(duì)其生物合成途徑進(jìn)行深入研究。通過(guò)多菌株基因組序列比對(duì)，對(duì)漢城霉素類生物合成基因簇進(jìn)行了鑒定，利用微生物學(xué)，分子生物學(xué)、底物化學(xué)衍生化、體外酶促反應(yīng)等手段從該基因簇中鑒定出一個(gè)新穎、可催化高階環(huán)加成反應(yīng)的酶。團(tuán)隊(duì)基于蛋白質(zhì)晶體數(shù)據(jù)，量子化學(xué)計(jì)算和蛋白質(zhì)定點(diǎn)突變技術(shù)，對(duì)該酶促動(dòng)力學(xué)過(guò)程進(jìn)行了深入解析，最終確定該酶通過(guò)“雙過(guò)渡態(tài)”來(lái)同時(shí)催化產(chǎn)生6+4和4+2環(huán)加成產(chǎn)物。該特殊高階環(huán)加成酶的發(fā)現(xiàn)，解答了“自然界中是否存在酶催化的高階環(huán)加成反應(yīng)”，這一持續(xù)五十余年的謎題。這類酶的發(fā)現(xiàn)將進(jìn)一步拓展人們對(duì)周環(huán)反應(yīng)酶的認(rèn)識(shí)，啟發(fā)科學(xué)家們將來(lái)利用和改造周環(huán)反應(yīng)酶來(lái)實(shí)現(xiàn)有價(jià)值的分子轉(zhuǎn)化。 成果于2019年4月以Letter形式發(fā)表于Nature。F1000評(píng)述該研究“鑒定首個(gè)高階環(huán)加成酶，拓展了環(huán)加成酶的認(rèn)知”，諾貝獎(jiǎng)得主霍夫曼評(píng)述“這是在酶促反應(yīng)中直接觀察到的[6+4]環(huán)加成產(chǎn)物的首個(gè)例子……，該研究對(duì)酶促高階環(huán)加成研究具有深遠(yuǎn)影響”。

磷脂酶D（PLD,EC 3.1.4.4）是一類廣泛存在于各種生物體的酶，具有水解作用和磷酰基轉(zhuǎn)移作用（見(jiàn)圖1）。作為一種酶制劑，PLD的轉(zhuǎn)磷脂酰活性尤為重要，被用于制備具有生物活性的稀有磷脂。其中，以大豆磷脂酰膽堿（PC）為底物，PLD酶法制備磷脂酰絲氨酸（PS），受到廣泛關(guān)注。PS作為腦健康營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，相繼被美國(guó)FDA、日本HBM和中國(guó)國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委所認(rèn)證，列為新資源食品。相較于提取自牛腦和植物的PS，生物酶法制備的PS，避免了食品安全和植物源含量低的問(wèn)題。進(jìn)一步，一些新的結(jié)構(gòu)和功能磷脂，通過(guò)PLD轉(zhuǎn)磷脂酰反應(yīng)被合成出來(lái)，例如，磷脂酰鯊肝醇、磷脂酰葡萄糖、心磷脂類似物、磷脂酰酪醇、磷脂酰萜烯和磷脂酰絲氨醇，它們中一些具有抗癌和抗氧化活性。 直到現(xiàn)在，受限于磷脂酶D來(lái)源不足和價(jià)格高（鏈霉菌屬PLD，≥150 units/mg，6516.9¥/1000 U，Sigma公司），其工業(yè)上的廣泛應(yīng)用受到限制。例如，文獻(xiàn)報(bào)道的PLD最高產(chǎn)量在104-105U·L-1，而制備轉(zhuǎn)化得到每公斤PS，需要2.6×106U的PLD。這一障礙的主要原因是高水平表達(dá)的PLD對(duì)宿主的嚴(yán)重細(xì)胞毒性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 歷經(jīng)5年時(shí)間，從上游到下游整體設(shè)計(jì)，我們解決了毒性蛋白（磷脂酶D，PLD）異源表達(dá)難的問(wèn)題（質(zhì)粒不穩(wěn)定、蛋白合成時(shí)間短、細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和裂解），PLD生產(chǎn)達(dá)到目前世界最高水平106U·L-1(748 mg·L-1)（提高20倍）；同時(shí)發(fā)展一種簡(jiǎn)單有效提取重組磷脂酶D的方法（無(wú)需破碎、無(wú)需添加溶菌酶和有機(jī)溶劑、室溫進(jìn)行），PLD生產(chǎn)成本有望降低20倍以上。按照實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的一臺(tái)5 L發(fā)酵罐，年產(chǎn)量可以提供3.5×108U的磷脂酶D，滿足100 kg的PS轉(zhuǎn)化需求計(jì)算（不計(jì)算PLD重復(fù)利用率），擴(kuò)大反應(yīng)器體積至100-1000 L，PLD產(chǎn)量可滿足制備2-20噸PS的需求。

本發(fā)明提供一種巴斯德畢赤酵母、產(chǎn)生的耐高溫蛋白酶及應(yīng)用，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域；本發(fā)明通過(guò)選育一種可產(chǎn)生耐高溫酶的巴斯德畢赤酵母(pichia pastoris)AN?PK?9K?GS115，然后將其進(jìn)行培養(yǎng)，從發(fā)酵液中提取耐高溫蛋白酶，將其用于羽毛粉的水解，可以有效水解羽毛粉，將其中蛋白質(zhì)組分高效降解為小肽成分或者氨基酸成分，從而提高蛋白質(zhì)的消化率，增加采食量，提高動(dòng)物健康水平。 （注：本項(xiàng)目發(fā)布于2019年）

本發(fā)明提供了一種固定化磷脂酶A1在制備磷脂DHA中的應(yīng)用，具體過(guò)程為，六水硝酸鈷和2?甲基咪唑分別溶于無(wú)水甲醇得到六水硝酸鈷溶液和2?甲基咪唑溶液，將2?甲基咪唑溶液滴加至六水硝酸鈷溶液中，攪拌反應(yīng)、靜置、干燥，得到ZIF?67納米材料，將ZIF?67納米材料于磷酸鈉緩沖液中混懸，加入磷脂酶A1溶液，調(diào)節(jié)pH，置于搖床孵育，離心、干燥，獲得ZIF?67納米材料固定化磷脂酶A1；將游離脂肪酸和大豆卵磷脂組成的底物和固定化磷脂酶A1在有機(jī)反應(yīng)體系中進(jìn)行催化反應(yīng)，分離純化獲得磷脂DHA。固定化磷脂酶A1，穩(wěn)定性好，催化制備磷脂DHA，DHA摻入率高達(dá)51.04%。

低分子量肝素(LMWH)是臨床上最主要的天然抗凝劑，目前主要是通過(guò)動(dòng)物來(lái)源的肝素進(jìn)行酶降解制得。歐洲藥典要求 LMWH 的分子量為 6000~8000，質(zhì)量控制是生產(chǎn) LMWH 的重要環(huán)節(jié)。而肝素酶的活性和利用率直接影響 LMWH 生產(chǎn)成本和產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)。 本項(xiàng)目組利用融合肝素酶 I (Hep I)與甲殼素之間的親和作用，實(shí)現(xiàn)酶的循環(huán)利用，同時(shí)融合酶活性和穩(wěn)定性提高。利用綠色溶劑體系制備形態(tài)完好、尺寸均一的甲殼素微球。用固定化酶制備的 LMWH 產(chǎn)品達(dá)到歐洲藥典要求，實(shí)現(xiàn)了分子量可控，生產(chǎn)過(guò)程可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。該項(xiàng)目將對(duì) LMWH 產(chǎn)業(yè)的綠色和經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)提供技術(shù)支持。目前已發(fā)表 SCI 論文 2 篇，并與相關(guān)企業(yè)開(kāi)展了合作。 

角蛋白酶是一種特異性蛋白酶類，可降解結(jié)構(gòu)復(fù)雜、硬質(zhì)難溶的角蛋白，具有多種優(yōu)良的催化特性，在生物加工、綠色制藥、廢棄生物質(zhì)處理、生物制革、生態(tài)紡織、洗滌劑等實(shí)際應(yīng)用中備受關(guān)注，被認(rèn)為是有著巨大應(yīng)用潛力和市場(chǎng)前景的新一代蛋白酶類。 本項(xiàng)目從角蛋白酶基因挖掘、高效表達(dá)、性能改造及其應(yīng)用研究等方面開(kāi)展了一系列工作。課題組目前建立了角蛋白酶資源庫(kù)，是我國(guó)擁有角蛋白酶基因資源產(chǎn)權(quán)最多和最具多樣性來(lái)源的單位；實(shí)現(xiàn)了角蛋白酶基因在大腸桿菌及枯草芽孢桿菌等外源宿主中的克隆及高效表達(dá)；在 5L 罐上發(fā)酵酶活最高可達(dá)10000 U/mL 以上，是目前文獻(xiàn)報(bào)道的重組角蛋白酶表達(dá)最高水平；項(xiàng)目已完成了 1M3 規(guī)模中試試驗(yàn)，成本降低 30%以上。在應(yīng)用方面，本項(xiàng)目成功將角蛋白酶用于生物法制備納米銀粒子 AgNPs，與傳統(tǒng)化學(xué)法相比，酶法合成的納米銀具有更好的抑菌活性。另外，項(xiàng)目組已首次開(kāi)發(fā)出無(wú)膠原活力的高特異性角蛋白酶，具有高角蛋白活力，不會(huì)對(duì)皮革膠原造成破壞，能保護(hù)膠原結(jié)構(gòu)完整性，可開(kāi)發(fā)出不傷及皮膚真皮的洗滌劑產(chǎn)品、藥品及化妝品，在生物制革領(lǐng)域也具有極大應(yīng)用價(jià)值，可緩解制革工業(yè)中的爛皮現(xiàn)象；同時(shí)本研究所開(kāi)發(fā)的角蛋白酶在活性多肽制備中也表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

本成果將人工魚礁用于江河水域的研究屬首次，研究也是基于對(duì)江河流 域魚類的體型特征及生活規(guī)律的深入調(diào)查，設(shè)計(jì)的人工礁體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)新穎，設(shè) 計(jì)的魚礁體的孔洞大小、高度、體積、重量及其功能專用于江河流域水域；從材 質(zhì)上來(lái)說(shuō)，本發(fā)明采用新型改性材料制作，隨著使用年限的延長(zhǎng)，人工魚礁表面 釋放到水中的鐵離子（鐵和氮、磷、硅一樣是限制浮游植物生長(zhǎng)的重要因素）可 以有效地改善小江水域營(yíng)養(yǎng)鹽的結(jié)構(gòu)。該魚礁對(duì)于我國(guó)江河流域今后開(kāi)發(fā)和利 用這種材料的魚礁具有一定的參考價(jià)值。該人工魚礁用于江河流域生態(tài)環(huán)境的改 善，作用主要體現(xiàn)在魚礁體對(duì)魚類的誘集效果以反附著底棲生物，從而達(dá)到魚類 增殖、生物多樣性保護(hù)、改善水質(zhì)環(huán)境的目的，具有明顯的環(huán)境效益，應(yīng)用及其 產(chǎn)業(yè)化前景良好。

本實(shí)用新型公開(kāi)了一種具有人工磁導(dǎo)體反射板的抗金屬RFID標(biāo)簽天線。一般常用的RFID天線常采用偶極子結(jié)構(gòu)，這類RFID天線使用在金屬材質(zhì)的物品上時(shí)，由于金屬的反射相位為180°的特性，天線輻射的電磁波會(huì)被反射波消減，造成增益下降；并且由于天線與金屬之間的近場(chǎng)耦合，天線阻抗會(huì)受到嚴(yán)重影響，造成能量效率下降。本實(shí)用新型針對(duì)標(biāo)簽天線應(yīng)用在金屬物品上的場(chǎng)合，使用彎折型偶極子標(biāo)簽天線，設(shè)計(jì)一種人工磁導(dǎo)體結(jié)構(gòu)放置于天線背面作為天線的反射板，從而改變背向反射特性，增大天線增益，同時(shí)減弱金屬對(duì)天線阻抗的影響，最終提高標(biāo)簽天線的閱讀距離。